הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות
Summary
ערכת האבחון המוצגת חליל-DNA היא שיטת חיסכון בזמן וידידותי למשתמש כדי לקבוע את ההסתברות האמינה של נוכחות של נגעים סרטן המעי הגס.
Abstract
בימינו, שרפרף DNA יכול להיות מבודד ומנותח על ידי מספר שיטות. שרידים ארוכים של דנ א בצואה ניתן להבחין על ידי הספק qPCR, המספק סבירות אמינה לנוכחות של נגעים טרום הנאופלסטית או נאופלסטית המעי הגס. שיטה זו, המכונה DNA ארוך הזריחה (FL-DNA), הוא הליך מהיר, פולשני שהוא שיפור על מערכת המניעה העיקרית. שיטה זו מבוססת על הערכה של שלמות ה-DNA צואה על ידי הגברה כמותית של יעדים ספציפיים של דנ א גנומית. בפרט, הערכה של שברי DNA יותר מ 200 bp מאפשר זיהוי של חולים עם נגעים המעי הגס עם ספציפיות מאוד. עם זאת, מערכת זו וכל בדיקות ה-DNA שרפרף הזמין כרגע להציג כמה בעיות כלליות שצריך להיות ממוען (למשל, את התדר שבו יש בדיקות צריך להתבצע מספר אופטימלי של שרפרף שנאסף בכל נקודת זמן עבור כל אדם). עם זאת, היתרון העיקרי של FL-DNA היא האפשרות להשתמש בו בשיתוף עם מבחן המשמש כיום בתוכנית ההקרנה CRC, המכונה כימיקלים מבוססי חיסוני בדיקת דם סמוי (iFOBT). אכן, שתי בדיקות ניתן לבצע על אותו מדגם, הפחתת עלויות והשגת חיזוי טוב יותר של נוכחות בסופו של דבר של נגעים המעי הגס.
Introduction
סרטן המעי הגס (CRC) נובע תהליך רב שלב שבו האפיתל בריא לאט מתפתחת לתוך אדנומות או פוליפים, אשר התקדמות קרצינומות ממאירים לאורך זמן1,2. למרות שיעור השכיחות הגבוה של CRC, מגמה כלפי מטה באחוז מקרי המוות נצפתה בעשור האחרון3. אכן, כלים אבחון מוקדם שאומצה תוכניות הקרנה הובילו גילוי מוקדם והסרה של אדנומות טרום הנאופלסטית או פוליפים4. עם זאת, בשל המגבלות הטכניות השונות, אף אחת מהשיטות הללו אינה אופטימלית. ואכן, כדי לשפר את הרגישות והספציפיות, הוצעו בדיקות דנ א שרפרף רבות בלבד או בשילוב עם בדיקות אבחון5שגרתיות 5,6.
בדרך כלל, רירית בריאה שופך את זרם הצואה האפוציטים, בעוד רירית החולה מפילינג הקולונציטים בלתי אפוטוטיות. שברים של 200 bp או יותר באורך לאפיין את ה-DNA לא אפוטוטית. ה-DNA הזה נקרא DNA ארוך (L-DNA) והפך utilizable ביוקרה לאבחנה מוקדמת CRC. ה-dna יכול להיות מבודד מדגימת צואה וכימות על ידי qpcr באמצעות בדיקת מחוץ למערכת האבחון של מבחנה-dna בערכה7,8,9,10,11,12.
הבדיקה מורכבת משני שאומר לאיתור שברי FL-DNA החל 138 bp כדי 339 bp. כל שיטת הזמן מאפשרת הגברה של FL-DNA (משפחה) כמו גם ספייק-DNA (HEX). כדי להבטיח הגברה אופטימלית של כל השברים, הבדיקה חולקה לשתי שמות (בשם “A” ו-“B”). השיטת A מזהה שני אזורים של אקסון 14 של גן הנגמ ש (NM_001127511) וחלק של אקסון 7 של הגן TP53 (NM_001276760). שיטת B מזהה קטע של אקסון 14 של הנגמ ש (NM_001127511) ושני אזורים של אקסון 5 ו-8 של הגן TP53 (NM_001276760). ההסכמה אינה מבדילה בין האזורים שזוהו. ה-DNA של הדקר מתאים ל-DNA הoncorהלופון הסלמון מאפשר אימות כי ההליך נעשה כראוי ובודק את הנוכחות האפשרית של מעכבי, אשר עשוי להניב תוצאות שליליות שווא. הריכוז חליל-DNA מוערך על ידי קוונפיקציה מוחלטת באמצעות שיטת העקומה הסטנדרטית והוא מתבטא כ ng/התגובה.
השיטה FL-dna היא לא פולשנית וזולה שרפרף DNA מבחן, כי, בשילוב עם מבוסס מבחינה כימית חיסוני בדיקת דם סמוי (ifobt), משמש כיום תוכניות הקרנת crc ומאפשר תחזיות טוב יותר של CRC ו/או בסיכון גבוה הנגעים אדנומה12.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים קודמים הוכיחו כי שלמות DNA ניתוח של שרפרפים שחולצו על ידי גישות ידניות וחצי אוטומטי יכול לייצג כלי אלטרנטיבי לגילוי מוקדם של נגעים המעי הגס7,8,9,10,11,12. מולקולרית, בדיקות ההקרנה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
למחברים אין ותודות.
Materials
| 1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
| Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
| EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
| EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
| Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
| Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
| Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
| Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |
References
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
- Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
- Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
- Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
- Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
- Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
- Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
- De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
- Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).
