Den presenterade diagnostiska FL-DNA kit är en tidsbesparande och användarvänlig metod för att bestämma den tillförlitliga sannolikheten för förekomsten av kolorektal cancer skador.
Numera kan avförings-DNA isoleras och analyseras med flera metoder. De långa fragmenten av DNA i avföringen kan detekteras genom en qPCR-analys, vilket ger en tillförlitlig sannolikhet för närvaron av pre-neoplastiska eller neoplastiska kolorektal lesioner. Denna metod, som kallas fluorescens lång DNA (FL-DNA), är en snabb, icke-invasiv förfarande som är en förbättring av det primära förebyggande systemet. Denna metod bygger på utvärdering av fekal DNA-integritet genom kvantitativ förstärkning av specifika mål för genomiskt DNA. I synnerhet gör utvärderingen av DNA-fragment längre än 200 bp för detektering av patienter med kolorektal skador med mycket hög specificitet. Detta system och alla tillgängliga avförings-DNA-tester uppvisar dock några allmänna frågor som måste åtgärdas (t.ex. hur ofta tester bör utföras och optimalt antal avföringsprover som samlas in vid varje tidpunkt för varje individ). Den största fördelen med FL-DNA är dock möjligheten att använda det i samband med ett test som för närvarande används i CRC screening program, känd som immunokemiska-baserade fekal ockulta blodprov (iFOBT). Faktum är att båda testerna kan utföras på samma prov, minska kostnaderna och uppnå en bättre förutsägelse av den eventuella förekomsten av kolorektal skador.
Kolorektal cancer (CRC) härrör från en flerstegsprocess där friska epitel långsamt utvecklas till adenom eller polyper, som utvecklas till maligna carcinom över tiden1,2. Trots CRC: s höga incidens, en nedåtgående trend i andelen dödsfall har observerats under det senaste decenniet3. Faktum är att tidiga diagnostiska verktyg som antagits i screening program har lett till tidig upptäckt och avlägsnande av pre-neoplastiska adenom eller polyper4. På grund av de olika tekniska gränserna är dock ingen av dessa metoder optimal. För att förbättra känsligheten och specificiteten har många avförings-DNA-tester föreslagits ensamma eller i kombination med aktuella rutinmässiga diagnostiska tester5,,6.
Typiskt, friska slemhinnan skjul i fekal ström apoptotiska kolonocyter, medan sjuka slemhinnan exfolierar icke-apoptotiska kolonocyter. Fragment av 200 bp eller mer i längd karakterisera icke-apoptotiska DNA. Detta DNA kallas lång DNA (L-DNA) och har blivit en utilizable biomarkör för CRC tidig diagnos. L-DNA kan isoleras från avföringsprovet och kvantifieras genom qPCR med hjälp av ett in vitro-diagnostiskt FL-DNA-kit7,,8,,9,,10,,11,12.
Testet består av två analyser för detektion av FL-DNA-fragment från 138 bp till 339 bp. Varje analys möjliggör förstärkning av FL-DNA (FAM) samt spike-in DNA (HEX). För att säkerställa optimal förstärkning av alla fragment har testet delats upp i två analyser (med namnet “A” och “B”). A-analysen detekterar två regioner av exon 14 av APC genen (NM_001127511) och ett fragment av exon 7 av TP53 genen (NM_001276760). B-analysen detekterar ett fragment av exon 14 av APC genen (NM_001127511) och två regioner av exons 5 och 8 av TP53 genen (NM_001276760). Analyserna skiljer inte mellan de regioner som upptäckts. Det instämda DNA:n motsvarar Oncorhynchus keta lax-DNA och möjliggör kontroll av att förfarandet har gjorts på rätt sätt och kontrollerar eventuell förekomst av hämmare, vilket kan ge falska negativa resultat. FL-DNA-koncentrationen utvärderas med absolut kvantifiering med hjälp av standardkurvan och uttrycks som ng/reaktion.
FL-DNA-metoden är ett icke-invasivt och billigt avförings-DNA-test som i kombination med det immunokemiska fekala ockulta blodprovet (iFOBT) för närvarande används i CRC-screeningprogram och möjliggör bättre förutsägelser av CRC och/eller högriskadenomlesioner12.
Tidigare studier har visat att DNA-integritetsanalys av avföring som extraherats genom manuella och halvautomatiska metoder kan utgöra ett alternativt verktyg för tidig upptäckt av kolorektal lesioner7,,8,,9,10,11,12. Molekylära, noninvasive screening tester har utvecklats under åren för att upptäcka kolorektal cancer…
The authors have nothing to disclose.
Författarna har inga erkännanden.
1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
Absolute Ethanol (quality of analytical degree) | Reagent required for DNA extraction | ||
Benchtop centrifuge | Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction | ||
EasyPGX analysis software version 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | Analysis software |
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well strips | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument recommended for the Real Time PCR assay |
EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit required for the Real Time PCR assay |
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
Powder-free disposable gloves | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool |
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL) | Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR | ||
Thermal block e.g. EasyPGX dry block | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrument required for DNA extraction |
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument required for DNA extraction |