Vi beskriver en metode til behandling af bronkoalveolær skylning væske og matchede perifert blod fra kronisk HIV-inficerede individer på antiretroviral behandling til at vurdere lunge-hiv-reservoirer. Disse metoder resulterer i erhvervelse af meget rene CD4 T-celler og alveolære makrofager, der efterfølgende kan anvendes til immunophenotyping og HIV DNA/RNA-kvantifikationer ved ultrasensitiv polymerase kædereaktion.
Bronskopi er en medicinsk procedure, hvorved normal saltvand injiceres i lungerne via en bronologisk anvendelsesområde og derefter suge påføres, fjerne bronskealveolær skylning (BAL) væske. Den BAL Fluid er rig på celler og kan således give et “øjebliksbillede” af lunge immun milieu. CD4 T-celler er de bedst karakteriserede HIV-reservoirer, mens der er stærke beviser for, at vævs makrofager, herunder alveolære makrofager (AMs), også tjener som virale reservoirer. Men, meget er stadig ukendt om rollen af AMs i forbindelse med HIV reservoir etablering og vedligeholdelse. Derfor, at udvikle en protokol til behandling af BAL Fluid at opnå celler, der kan anvendes i virologiske og immunologiske analyser til at karakterisere og evaluere cellepopulationer og undergrupper i lungerne er relevant for forståelsen af lunge rollen som HIV Reservoirer. Heri beskriver vi en sådan protokol, hvor der anvendes standardteknikker såsom simpel centrifugering og strømnings cytometri. CD4 T-cellerne og AMs kan derefter anvendes til efterfølgende anvendelser, herunder immunophenotyping og HIV-DNA og RNA-kvantificering.
En af de mest betydningsfulde udfordringer for en kur mod hiv-infektion er tilstedeværelsen af det latente hiv-reservoir, som forårsager en rebound af plasma-observeres efter afbrydelse af antiretroviral behandling (art)1,2. Mens HIV-reservoiret under langsigtet kunst er veldokumenteret i flere vævs segmenter, herunder sekundære lymfoide organer, Gut-associeret lymfoide væv (GALT), og centralnervesystemet (CNS), er lungerne blevet overset som et område af studiet siden den præ-ART æra3. Men lungerne spiller en central rolle i patogenesen af HIV. Faktisk var pulmonale symptomer blandt de første indikatorer for AIDS-relaterede opportunistiske infektioner4. Selv i den moderne kunst æra, personer med HIV er i en større risiko for at udvikle både infektiøse og ikke-infektiøse lungesygdomme end personer uden HIV. For eksempel er personer med hiv-infektion forhøjet risiko for invasiv streptokok pneumoniae infektion, samt kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)5,6. Desuden er coinfektion af tuberkulose (TB) og HIV en betydelig folkesundheds udfordring i visse regioner i verden, især Afrika syd for Sahara, da HIV-smittede personer er 16 til 27 gange større sandsynlighed for at have TB end personer uden HIV7. Selv om nogle forklaringer på denne følsomhed over for lungebetændelse og kronisk sygdom er blevet foreslået8,9,10, de præcise cellulære mekanismer, hvormed personer med undertrykt hiv plasma virusbelastning fortsat er højere risiko for lungekomplikationer er ikke fuldt belyst. Vigtigere er, HIV er en meget stærk risikofaktor for lungebetændelse og kronisk sygdom, uafhængig af rygestatus6.
Analyse af immun miljøet i lungerne er derfor afgørende for at forstå sin rolle i sundhed og sygdom. Selv om noninvasive, induceret sputum prøver tendens til at indeholde store mængder af epiteliale celler og snavs med sjældne pulmonale lymfocytter og ingen AMs, begrænse deres rolle til specifikke anvendelser. Omvendt kan store biopsier af væv ikke opnås i fravær af mistanke om sygdom på grund af tilknyttede risici for signifikant blødning og pneumothorax (kollaps af lungerne). Desuden er størstedelen af pulmonale immunceller hovedsageligt placeret på slimhinde niveau, hvor lungerne kontinuerligt stimuleres af antigener under vejrtrækningen. Med henblik herpå har bronskopi til opnåelse af BAL væske den fordel, at det giver relativt sikker adgang til lymfocytter og AMs (Se figur 1). Makrofager udgør den største andel af celler inden for BAL Fluid, efterfulgt af lymfocytter11. Det er derfor nyttigt at fastsætte en metode, hvormed BAL-væske kan forarbejdes til anvendelse i efterfølgende anvendelser, såsom immunophenotyping, cellekultur, transkriptomik eller andre anvendelser. Protokollen til behandling af den modvæske, der er skitseret her, er tilpasset generelle procedurer, der tidligere er beskrevet og optimeret for de forskellige downstream-assays, som er beskæftiget. Denne metode giver mulighed for isolering af både pulmonal lymfoide og myeloid slimhinde immunceller for deres fænotypiske og funktionelle karakterisering, samt en vurdering af HIV-reservoiret hos voksne, som lever med HIV.
For at etablere denne protokol brugte vi følgende kriterier til at rekruttere studiedeltagere15. For at deltagerne kan deltage i denne undersøgelse, skal de være HIV-inficerede personer, der opfylder følgende kriterier: (1) på kunst i mindst 3 år; (2) undertrykt viral Load (VL) i mindst 3 år; (3) CD4 T-celletal på ≥ 200/mm3; (4) villige til at gennemgå forskning Spirometri og bronskopi. Patienter med følgende kriterier blev udelukket fra studiet: (1) kontraindikation (er) til bronskopi; (2) høj blødningsrisiko: koagulopati eller warfarin-eller clopidogrel-behandling; (3) trombocytopeni (lave trombocytter); (4) aktiv Lungeinfektion eller anden akut pulmonal proces; (5) gravid/forsøger at blive gravid.
Heri beskrev vi en metode til behandling af BAL Fluid for at opnå CD4 T-celler og AMs, sammen med matchede PBMCs, som kan undersøges for at undersøge HIV-reservoiret i lungerne. Vi rapporterede for nylig om HIV DNA kvantificering i CD4 T-celler fra matchede perifert blod og BAL prøver, og vores gruppe viste, at HIV er 13 gange mere rigelige i pulmonale CD4 T-celler end i dem fra perifert blod15. Niveauerne af HIV-DNA i AMs er imidlertid donor afhængige, og derfor har der indtil videre ikke været en konsekvent sammenhæng mellem HIV-DNA-niveauerne i lymfocytter sammenlignet med makrofager15. Adgangen til disse primære makrofag celle undersæt vil imidlertid være et vigtigt redskab til at afhøre dette spørgsmål og få en bedre forståelse af den virale belastning i lungerne i forbindelse med HIV-reservoiret.
I pre-ART æra og i flere andre undersøgelser udnytter BAL Fluid, deltagerne gennemgik bronkopopi for at diagnosticere en mistænkt patologi eller få en mikrobiologisk diagnose for Respiratoriske symptomer3. Vi var dog i stand til at rekruttere deltagere uden aktive lungesymptomer eller patologier, og alle deltagere underskrev en etisk samtykkeformular15. Vi var i stand til at rekruttere deltagere fra vores Center, som deltog i andre undersøgelser, såsom en Spirometri screeningundersøgelse for obstruktiv lungesygdom24, samt dem, der gennemgår andre forsknings procedurer, såsom leukaferese og Koloskopi. Tidligere forskning blandt mennesker, der lever med HIV viste, at altruisme er en nøglefaktor motiverende deltagelse i forskningsundersøgelser25. Ligesom med mange humane prøver bemærkede vi en stor del af person-til-person variabilitet. Der var ingen måde at “forudsige” fra hvilke deltagere vi ville få BAL med god versus dårlig celle udbytter. I modsætning til perifert blod, som giver temmelig konsekvent antal lymfocytter, celle numrene i BAL Fluid er meget varierende. Indsprøjtning af en større mængde af normal saltvand i lungerne (med håb om at opnå en større tilbagevenden af BAL væske) er ikke altid muligt, da større mængder af normal saltvand er ofte forbundet med mere hoste og en højere risiko for feber postbronkoskopi. Vi bemærkede, at ved hjælp af en mindre (snarere end større) diameteren bronkier muliggjorde respirologist at nå dybere ind i bronkierne og opnå væske, der indeholder større mængder af celler. En konsekvent konstatering var, at tobaks rygere havde meget større andele af AMS end lymfocytter inden for deres bal væske, som forventes som AMS opsluge snavs og partikler. Desuden bemærkede vi, at BAL væske fra rygere indeholdt snavs, som kan blokere det anvendte udstyr, såsom PCR-maskiner og flow-cytometre. Lignende problemer kan observeres i områder med høj forurening eller personer, der oftere udsættes for dårlig luftkvalitet.
Med hensyn til deres rolle i etableringen af HIV-reservoirer og viral vedholdenhed er renheden af CD4 T-celler og AMs en vigtig overvejelse. Derfor valgte vi at bruge fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS) for at opnå meget rene cellepopulationer. Det er også muligt, at den indsamlede BAL væske kan være forurenet med blod som nogle mindre blødning forventes under en bronskopi; tilstedeværelsen af naive B-celler ville indikere dette, og cellerne kan vaskes i en rød blod cellelyse buffer for at omgå dette problem. En anden udfordring med at studere BAL Fluid vedrører kvantificering af inflammatoriske markører og cytokiner, som er vigtige for forståelsen af HIV-persistens26. Da det indpolede saltvand fortynder den BAL væske, niveauer af inflammatoriske mediatorer og cytokiner kan være vanskeligt at måle. Selv om en urinstof korrektionsfaktor er blevet foreslået til at tage højde for fortynding, der er relativt lidt litteratur beskriver dens anvendelse27,28.
AMS er meget Auto-luorescent, hvilket udgør et problem under celle sortering og flow flowcytometri fænotypic analyse. Især effekten er mere udtalt i rygere, hvis AMs kan være helt sort i farve, betydeligt påvirker deres autofluorescens. Når den er ophidset af en standard blå 488 nm laser, er am autofluorescens på sit højeste ved ca. 540 nm, som overlapper med fluorescens spektre af almindeligt anvendte konjugater som FITC og PE29,30. Det er værd at bemærke, at to separate lasere kan bruges til at begejstre FITC og PE (f. eks PE ved den gule/grønne og FITC af den blå 488 laser). For at overvinde den iboende autofluorescens med FITC brugte vi unstained AMs til at bestemme autofluorescens baggrund. Desuden kan brugen af fluorescens minus en (FMO) kontrol være meget nyttig til at bekæmpe disse tekniske problemer. Større perler (f. eks. 7,5 μm) kan anvendes, som er tættere i størrelse til at kompensere makrofag populationer, sammenlignet med mindre perler (f. eks., 3,0 μm), som kan anvendes til at kompensere lymfocyt populationer. En endnu mere hensigtsmæssig fremgangsmåde ville være at bruge en lille brøkdel af cellerne som en enkelt plet kontrol ved hjælp af en kendt, stærkt udtrykt markør på delsættet, såsom HLA-DR eller CD45, konjugeret til hver af de ønskede fluorchromes, hvilket ville give mulighed for en langt mere nøjagtig kompensation, end der kan opnås med perler. I tilfælde af rygere ‘ prøver, denne taktik er især nyttig som makrofager er meget større og mere Auto-luorescent. Ud fra forberedelses trinnet kunne hele prøve prøven dyrkes i en tallerken inden sortering som beskrevet i afsnit 3 i protokollen for at muliggøre en adskillelse af befolkningerne ved overholdelse. På denne måde kan de vedhængende makrofager isoleres fra andre ikke-vedhængende celler såsom lymfocytter. Kompensationen er langt mindre udfordrende, hvis lymfocyt-og AM-populationer adskilles i stedet for at blive undersøgt sammen. men at stole på overholdelse vil resultere i et tab af makrofager, hvilket er en vigtig overvejelse, når cellenumre er allerede begrænsende. Også, en overholdelse skridt kunne resultere i uønsket aktivering af overholder monocytter, som kan påvirke downstream resultater genereret ved hjælp af disse celler. Værdien af effektivt at sortere celler i renere populationer skal opvejes mod begrænsningen af at have færre sådanne celler til efterfølgende eksperimenter.
Andre modeller, især murine modeller, er blevet brugt til at studere makrofag immunologiske egenskaber og biologi. Mens disse modeller er yderst nyttige og giver stor indsigt i en celletype, der er svært at manipulere, har de begrænsninger. Mange af celleoverflade mærkerne varierer mellem mus og mennesker, således at immunophenotypen af human AMs ikke er helt forstået. Men denne model system kræver pooling af flere mus til assays på grund af de lave cellenumre til rådighed fra hvert dyr. Hertil kommer, at nødvendigheden af at samle enheder udelukker overvejelser om genetisk disposition og køn. For nylig har det vist sig, at sex spiller en rolle i infektiviteten af makrofager ved HIV-1 på grund af det uensartede udtryk for restriktions faktoren SAMHD-131. Ikke-menneskelige primater (NHP) repræsenterer den nærmeste model for mennesker og faciliterede studiet af en infektion med Simian immundefektvirus (SIV) og dens virkning på immunsystemet, hvilket giver indsigt i den rolle, som vævs residente makrofager spiller i forhold til de monocytter-afledte makrofager. I rhesus macaques, det er også blevet påvist, at lunge makrofag isolater fra BAL Harbor en replikation-kompetente virus; en viral udvækst assay (VOA) blev brugt til at analysere opførsel af siv i væv-residente celler32. En sådan konstatering er af betydelig forsknings værdi, men skal stadig valideres hos mennesker, før den kan anvendes, og de høje omkostninger ved at anvende NHP’er udelukker brugen af store prøve populationer. Desuden, Human AMs vil være nyttigt for mange andre anvendelser såsom in vitro viral/mikrobiel infektion assays og i undersøgelser af andre patogener såsom tuberkulose/HIV coinfektion.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende deres finansieringskilder: de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR) (Grant #153082 til CC, MAJ, NC); Réseau SIDA et maladies infekeuses du fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S), der ydede støtte til CC og MAJ og McGill University Faculty of Medicine, der ydede støtte til CC. Denne undersøgelse blev også støttet i en del af de canadiske institutter for sundhed Research (CIHR)-finansierede canadiske HIV Cure Enterprise (CanCURE) hold Grant HB2 – 164064 til MAJ, CC og NC. MAJ holder CIHR Canada forsknings stol Tier 2 i Immunovirology og CC og NC holde en FRQ-S Junior 1 og Junior 2 Research løn Award, hhv. ET besidder en RI-MUHC Studentship MSc-pris.
Desuden vil forfatterne gerne anerkende Josée Girouard og alle kliniske medarbejdere, der er involveret i at koordinere og indhente prøverne, samt de respiratoriske terapeuter; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette og Marie-Hélène Lacombe ved RI-MUHC Immunophenotyping-platformen; og Dr. Marianna Orlova for tilvejebringelse af mikroskopi fotos. Vigtigst af alt, forfatterne ønsker at takke de mange frivillige, uden hvem denne forskning ikke ville være muligt.
70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22363548 | Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting |
ACH-2 Cells | NIH | 349 | HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4 |
BD FACSAria | BD Biosciences | N/A | Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously) |
BD LSRFortessa X-20 | BD Biosciences | N/A | Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously) |
Bronchoscope | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm |
Cell Disassociation Solution | Sigma | C5914 | Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces. |
CD169 BB515 | BD Biosciences | 565353 | Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry |
CD14 BV786 | BD Biosciences | 563698 | Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry |
CD206 PE | BD Biosciences | 555954 | Mannose receptor antibody used for flow cytometry |
CD3 Alexa700 | BD Biosciences | 557943 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
CD4 PE-Cy5 | BD Biosciences | 555348 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
CD45 PE Cy-7 | BD Biosciences | 557748 | Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry |
CD8 BV605 | BD Biosciences | 564116 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
CompBead Plus | BD | 560497 | Anti-mouse Ig, κ and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry |
DNase I | Invitrogen | 18068015 | Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA |
dNTP Set 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells |
EDTA | Invitrogen | AM9912 | Used to stop Dnase I enzyme activity |
FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | Premium fetal bovine serum to supplement media |
FcR Blocking Reagent, Human | Miltenyi | 130-059-901 | Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies |
FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | Flow cytometry analysis software used for all analyses |
HLA-DR BV650 | BD Biosciences | 564231 | MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry |
HyClone HEPES solution | Fisher Scientific | SH3023701 | Buffer providing maintenance of physiological pH |
Live/Dead APC-H7 | Invitrogen | L34975 | Viability marker used for flow cytometry |
Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1°C/minute, the optimal rate for cell preservation |
OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples |
PBS 1X | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | Phosphate buffered saline for cell washing and staining |
PCR Tubes Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene |
PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates |
QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers |
Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | Real-time PCR cycler |
RPMI 1640 1X | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Cell culture media |
Sterile Water | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase, RNase & protease free |
Superscript™ III One-Step RT-PCR System | Invitrogen | 12574018 | RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate |
Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride |
Transcription Factor Buffer Set | BD Biosciences | 562725 | Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer |
Trypan Blue | Sigma | T8154 | Viability dye to count cells using haemacytometer |