Vi beskriver en metode for behandling av lunges og matchet perifert blod fra kronisk HIV-smittede personer på antiretroviral behandling for å vurdere lunge HIV-reservoarer. Disse metodene resulterer i oppkjøpet av svært rene CD4 T-celler og alveolære makrofager som senere kan brukes til immunfenotyping og HIV DNA/RNA-quantifications ved ultrasensitive polymerase kjedere reaksjon.
Bronkoskopi er en medisinsk prosedyre der normal saltvann injiseres inn i lungene via en bronkoskop og deretter sug påføres, fjerne lunges tømming (BAL) væske. BAL-væsken er rik på celler og kan dermed gi et “øyeblikksbilde” av lunge immun miljøet. CD4 T-celler er den best preget HIV-reservoarene, mens det er sterke bevis som tyder på at vev makrofager, inkludert alveolære makrofager (AMs), også tjene som viral reservoarer. Men mye er fortsatt ukjent om rollen som AMs i sammenheng med HIV reservoar etablering og vedlikehold. Derfor, utvikle en protokoll for behandling av BAL væske for å få celler som kan brukes i virological og immunologiske analyser for å karakterisere og evaluere cellen populasjoner og delsett innen lunge er relevant for å forstå rollen til lungene som HIV Reservoarer. Heri, beskriver vi en slik protokoll, ansette standard teknikker som enkle sentrifugering og flyt flowcytometri. CD4 T-cellene og AMs kan deretter brukes til senere bruk, inkludert immunfenotyping og HIV-DNA og RNA-kvantifisering.
En av de viktigste utfordringene mot en kur mot HIV-smitte er tilstedeværelsen av den latente HIV reservoaret som forårsaker en rebound av plasma viremia etter avbrudd av antiretroviral behandling (art)1,2. Mens HIV reservoaret under langsiktige ART er godt dokumentert i flere vev avdelinger, inkludert sekundære lymfoide organer, gut-assosiert lymfoide vev (GALT), og sentralnervesystemet (CNS), lungene har blitt oversett som et område av studien siden pre-ART era3. Men lungene spiller en sentral rolle i patogenesen av HIV. Faktisk var lungesymptomer blant de første indikatorene på AIDS-relaterte opportunistiske infeksjoner4. Selv i den moderne ART æra, personer med HIV er en større risiko for å utvikle både smittsomme og noninfectious lungesykdommer enn personer uten HIV. For eksempel, personer med HIV-smitte har forhøyet risiko for invasiv streptokokk pneumoniae infeksjon, samt kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)5,6. Videre er Coinfection av tuberkulose (TB) og HIV en betydelig folkehelse utfordring i enkelte regioner av verden, spesielt, Afrika sør for Sahara, som HIV-smittede individer er 16 til 27 ganger større sannsynlighet for å ha TB enn personer uten HIV7. Selv om noen forklaringer på denne mottakelighet for lungeinfeksjon og kronisk sykdom har blitt foreslått8,9,10, den presise cellulære mekanismer som individer med undertrykt HIV plasma viral belastning forbli i høyere risiko for lunge komplikasjoner har ikke blitt fullstendig belyst. Viktigere er HIV en veldig sterk risikofaktor for lungeinfeksjon og kronisk sykdom, uavhengig av røyke status6.
Analyse av immun miljøet i lungene er derfor avgjørende for å forstå sin rolle i helse og sykdom. Selv om ikke-invasiv, indusert sputum prøver tendens til å inneholde store mengder av epitelceller og rusk med sjeldne lunge-lymfocytter og ingen AMs, begrense sin rolle til bestemte applikasjoner. Omvendt kan store biopsier av vev ikke oppnås i fravær av mistanke om sykdom på grunn av assosiert risiko for betydelig blødning og pneumotoraks (kollaps av lungene). Videre, flertallet av lunge immunceller er hovedsakelig plassert på slimhinne nivå der lungene er kontinuerlig stimulert av antigener under pusting. For dette formål, bronkoskopi å få BAL Fluid har fordelen av å gi relativt sikker tilgang til lymfocytter og AMs (se figur 1). Makrofager utgjør den største andelen av celler innen BAL-væske, etterfulgt av lymfocytter11. Det er derfor nyttig å etablere en metode der BAL-væsken kan behandles for bruk i etterfølgende programmer, for eksempel immunfenotyping, cellekultur, transcriptomics eller andre programmer. Protokollen for behandling av BAL-væsken som er skissert her, er tilpasset fra generelle prosedyrer som tidligere er beskrevet og optimalisert for de ulike nedstrøms analysene som brukes. Denne metodikken gjør det mulig for isolering av både lunge lymfoide og myelogen slimhinne immunceller for deres phenotypical og funksjonell karakterisering, samt en vurdering av HIV-reservoaret i voksne som lever med HIV.
For å etablere denne protokollen, brukte vi følgende kriterier for å rekruttere studiedeltakere15. For deltakerne å være kvalifisert til å delta i denne studien, måtte de være HIV-smittede individer som møtte følgende kriterier: (1) på ART i minst 3 år; (2) undertrykt viral Load (VL) i minst 3 år; (3) CD4 T celle tall ≥ 200/mm3; (4) villig til å gjennomgå forskning Spirometri og bronkoskopi. Pasienter med følgende kriterier ble ekskludert fra studien: (1) kontraindikasjon (e) til bronkoskopi; (2) høy blødningsrisiko: koagulopati eller på warfarin eller klopidogrel terapi; (3) trombocytopeni (lav blodplater); (4) aktiv lungeinfeksjon eller annen akutt pulmonic prosess; (5) gravid/prøver å bli gravid.
Heri har vi beskrevet en metode for behandling av BAL Fluid å få CD4 T celler og AMs, sammen matchet Pbmc, som kan bli studert for å undersøke HIV reservoaret i lungene. Vi har nylig rapportert om HIV DNA kvantifisering i CD4 T-celler fra matchet perifert blod og BAL prøver, og vår gruppe viste at HIV er 13 ganger mer rikelig i lunge CD4 T-celler enn i de fra perifert blod15. Men nivåene av HIV-DNA i AMs er donor-avhengige og så, så langt har det ikke vært en konsistent sammenheng mellom HIV-DNA nivåer i lymfocytter sammenlignet med makrofager15. Tilgangen til disse primære macrophage celle delsett, men vil være et viktig verktøy for å forhører dette spørsmålet og få en bedre forståelse av viral belastning i lungene i sammenheng med HIV-reservoaret.
I pre-ART æra og i flere andre studier utnytte BAL væske, deltakerne gjennomgikk bronkoskopi for å diagnostisere en mistenkt patologi eller få en mikrobiologisk diagnose for respiratoriske symptomer3. Vi var imidlertid i stand til å rekruttere deltakere uten aktive lungesymptomer eller patologi, og alle deltakerne signerte et etisk samtykke skjema15. Vi var i stand til å rekruttere deltakere fra vårt senter som deltok i andre studier, for eksempel en Spirometri screening studie for obstruktiv lungesykdom24, samt de som gjennomgår andre forsknings prosedyrer, for eksempel leukaferese og Koloskopi. Tidligere forskning blant mennesker som lever med HIV demonstrert at altruisme er en viktig faktor motiverende deltakelse i forskningsstudier25. Som med mange menneskelige prøver, noterte vi en stor del av person-til-person variasjon. Det var ingen måte å “forutsi” som deltakerne vi ville få BAL med god versus dårlig celle gir. I motsetning til perifert blod, som gir ganske konsistent antall lymfocytter, celle tallene i BAL Fluid er svært variabel. Injisere et større volum av normal saltvann i lungene (med håp om å få en større avkastning på BAL væske) er ikke alltid mulig som større volumer av normal saltvann er ofte forbundet med mer hoste og en høyere risiko for feber postbronchoscopy. Vi la merke til at ved hjelp av en mindre (i stedet for større) diameter bronkoskop aktivert respirologist å nå dypere inn i bronkiene og få væske som inneholder større mengder av celler. En konsistent funn var at tobakk røykere hadde mye større proporsjoner av AMs enn lymfocytter innenfor deres BAL-væske, som er forventet som AMs sluker rusk og partikler. Videre observerte vi at BAL væske fra røykere inneholdt rusk som kan blokkere utstyret som brukes, for eksempel PCR-maskiner og strømnings cytometers. Lignende problemer kan observeres i områder med høy forurensning eller individer eksponert oftere til dårlig luftkvalitet.
Med hensyn til deres rolle i etableringen av HIV-reservoarer og viral utholdenhet, renheten av CD4 T-celler og AMs er en viktig faktor. Av denne grunn valgte vi å bruke fluorescens-aktiverte celle sortering (FACS) for å oppnå svært rene celle populasjoner. Det er også mulig at den innsamlede BAL væsken kan være forurenset med blod som noen mindre blødning er forventet under en bronkoskopi; tilstedeværelsen av naive B-celler ville indikere dette, og cellene kan vaskes i en rød blod cellelyse buffer for å omgå dette problemet. En annen utfordring med å studere BAL væske relaterer til kvantifisere inflammatoriske markører og cytokiner, som er viktige for å forstå HIV utholdenhet26. Som innpodet saltvann utvanner BAL Fluid, nivåer av inflammatoriske meglere og cytokiner kan være vanskelig å måle. Selv om en urea korreksjon faktor har blitt foreslått å gjøre rede for fortynning, er det relativt lite litteratur som beskriver bruken27,28.
AMs er svært autofluorescent, som utgjør et problem under celle sortering og flyt flowcytometri fenotypiske analyse. Spesielt effekten er mer uttalt hos røykere som AMs kan være helt svart i fargen, betydelig påvirker deres autofluorescence. Når opphisset av en standard blå 488 NM laser, er am autofluorescence på sitt høydepunkt på ca 540 NM, som overlapper med fluorescens Spectra brukte konjugater som FITC og PE29,30. Det er verdt å merke seg at to separate lasere kan brukes til å opphisse FITC og PE (f. eks PE av gul/grønn og FITC av den blå 488 laser). For å overvinne den iboende autofluorescence med FITC, brukte vi unstained AMs for å bestemme autofluorescence bakgrunn. I tillegg kan bruken av fluorescens minus en (FMO)-kontroller være svært nyttig for å bekjempe disse tekniske problemene. Større perler (f. eks 7,5 μm) kan brukes, som er nærmere i størrelse for kompenserende macrophage populasjoner, sammenlignet med mindre perler (f. eks 3,0 μm), som kan brukes for kompenserende lymfocytter. En enda mer egnet tilnærming ville være å bruke en liten brøkdel av celler som enkelt-flekken kontroller, ved hjelp av en kjent, svært uttrykt markør på undergruppe, for eksempel HLA-DR eller CD45, bøyd til hver av de ønskede fluorokromer, som ville gi rom for en mye mer nøyaktig kompensasjon enn det som kan oppnås med perler. I tilfelle av røykere ‘ prøver, er denne taktikken spesielt nyttig som makrofager er mye større og mer autofluorescent. I tillegg, fra utarbeidelsen trinn, kan hele BAL prøven være kultivert i en tallerken før sortering som beskrevet i del 3 av protokollen, for å tillate en separasjon av befolkningen ved tilslutning. På denne måten kan tilhenger makrofager isoleres fra andre nonadherent celler som lymfocytter. Kompensasjon er langt mindre utfordrende dersom lymfocytter og AM-populasjoner er separert i stedet for undersøkt sammen; men å stole på etterlevelse vil resultere i tap av makrofager, som er en viktig faktor når celle tall er allerede begrensende. Også, en tilslutning skritt kan føre til uønsket aktivering av tilhenger monocytter, som kan påvirke nedstrøms resultater generert ved hjelp av disse cellene. Verdien av effektivt å sortere celler til renere populasjoner må veies opp mot begrensningen av å ha færre slike celler for senere eksperimenter.
Andre modeller, spesielt murine modeller, har blitt brukt til å studere macrophage immunologiske egenskaper og biologi. Selv om disse modellene er svært nyttige og gir stor innsikt i en celle type som er vanskelig å manipulere, har de begrensninger. Mange av celleoverflaten markører varierer mellom mus og mennesker slik at immunophenotype av menneskelig AMs er ikke helt forstått. Imidlertid krever denne modellen systemet pooling av flere mus for analyser på grunn av den lave celle tall tilgjengelig fra hvert dyr. I tillegg er nødvendigheten av å Pool prøvene utelukker betraktninger av genetisk predisposisjon og sex. Nylig har det vært vist at sex spiller en rolle i infectivity av makrofager av HIV-1 på grunn av ulike uttrykk for begrensningen faktor SAMHD-131. Nonhuman primater (NHP) representerer den nærmeste modellen til mennesker og tilrettelagt studiet av Simian immunsviktvirus (SIV) infeksjon og dens effekt på immunsystemet, gir innsikt i rollen som vev-Resident makrofager i forhold til monocytt-avledet makrofager. I rhesus aper, det har også vist at lunge macrophage isolerer fra BAL Harbor en replikering-kompetent virus; en viral utvekst analysen (VOA) ble brukt til å analysere oppførselen til SIV i vev-Resident celler32. En slik oppdagelse er av betydelig forsknings verdi, men må fortsatt være validert hos mennesker før den kan anvendes, og den høye kostnaden ved å bruke NHPs utelukker bruk av store utvalgs populasjoner. I tillegg vil menneskelige AMs være nyttig for mange andre programmer som in vitro viral/mikrobiell infeksjon analyser og i studier av andre patogener som tuberkulose/HIV Coinfection.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne erkjenne sine Oppdragsgivers: Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (gi #153082 til CC, MAJ, NC); Réseau SIDA et sykdommer infectieuses du fonds de Recherche du Québec-santé (FRQ-S) som innvilget finansiering til CC og MAJ og McGill University Faculty of Medicine som innvilget finansiering til CC. Denne studien ble også støttet i del Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-finansiert kanadiske HIV Cure Enterprise (Dukurere) Team Grant HB2-164064 til MAJ, CC og NC. MAJ holder CIHR Canada Research Chair Tier 2 i Immunovirology og CC og NC holder en FRQ-S Junior 1 og Junior 2 forskning lønn prisen, henholdsvis. ET har en RI-MUHC studentship MSc Award.
I tillegg vil forfatterne ønsker å erkjenne Josée Girouard og alle kliniske ansatte involvert i koordinering og innhenting av prøvene, så vel som luftveiene terapeuter; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette, og Marie-Hélène Lacombe på RI-MUHC Immunfenotyping plattform; og Dr. Marianna Orlova for levering av mikroskopi bilder. Viktigst, forfatterne ønsker å takke de mange frivillige uten hvem denne forskningen ikke ville være mulig.
70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22363548 | Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting |
ACH-2 Cells | NIH | 349 | HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4 |
BD FACSAria | BD Biosciences | N/A | Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously) |
BD LSRFortessa X-20 | BD Biosciences | N/A | Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously) |
Bronchoscope | Olympus | BF-1TH190 | EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm |
Cell Disassociation Solution | Sigma | C5914 | Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces. |
CD169 BB515 | BD Biosciences | 565353 | Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry |
CD14 BV786 | BD Biosciences | 563698 | Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry |
CD206 PE | BD Biosciences | 555954 | Mannose receptor antibody used for flow cytometry |
CD3 Alexa700 | BD Biosciences | 557943 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
CD4 PE-Cy5 | BD Biosciences | 555348 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
CD45 PE Cy-7 | BD Biosciences | 557748 | Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry |
CD8 BV605 | BD Biosciences | 564116 | T cell co-receptor antibody used for flow cytometry |
CompBead Plus | BD | 560497 | Anti-mouse Ig, κ and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry |
DNase I | Invitrogen | 18068015 | Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA |
dNTP Set 100 mM | Invitrogen | 10297-018 | Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells |
EDTA | Invitrogen | AM9912 | Used to stop Dnase I enzyme activity |
FBS | Wisent Bioproducts | 080-150 | Premium fetal bovine serum to supplement media |
FcR Blocking Reagent, Human | Miltenyi | 130-059-901 | Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies |
FlowJo v10 | FlowJo LLC | N/A | Flow cytometry analysis software used for all analyses |
HLA-DR BV650 | BD Biosciences | 564231 | MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry |
HyClone HEPES solution | Fisher Scientific | SH3023701 | Buffer providing maintenance of physiological pH |
Live/Dead APC-H7 | Invitrogen | L34975 | Viability marker used for flow cytometry |
Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1°C/minute, the optimal rate for cell preservation |
OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-41 | Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples |
PBS 1X | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | Phosphate buffered saline for cell washing and staining |
PCR Tubes Corbett Rotor-Gene | Axygen | PCR-0104-C | 4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene |
PerfeCTa qPCR ToughMix | Quantabio | 95112 | 2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates |
QiaAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers |
Rotor-Gene Q | Qiagen | 9001550 | Real-time PCR cycler |
RPMI 1640 1X | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | Cell culture media |
Sterile Water | Wisent Bioproducts | 809-115-CL | DNase, RNase & protease free |
Superscript™ III One-Step RT-PCR System | Invitrogen | 12574018 | RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate |
Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride |
Transcription Factor Buffer Set | BD Biosciences | 562725 | Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer |
Trypan Blue | Sigma | T8154 | Viability dye to count cells using haemacytometer |