Tecnologia CRISPR/Cas9 nel ripristino dell'espressione della distrofina nei progenitori muscolari derivati da iPSC
Summary
Qui, presentiamo un protocollo di eliminazione exon23 basato su Cas9 per ripristinare l’espressione distrofina in iPSC da fibroblasti cutanei derivati da mousemdx Dmd e differenziare direttamente gli iPSC in cellule progenitrici miogenie (MPC) utilizzando il sistema di attivazione Tet-on MyoD.
Abstract
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una grave malattia muscolare progressiva causata da mutazioni nel gene della distrofina, che alla fine porta all’esaurimento delle cellule progenitrici muscolari. L’editing genico a breve area(CRISPR/Cas9) interspaziale regolarmente interspaziale ha il potenziale per ripristinare l’espressione del gene della distrofina. Le cellule progenitrici muscolari derivate da cellule staminali muscolari (MPC) autologhe indotte possono ricostituire il pool di cellule staminali/progenitrici, riparare i danni e prevenire ulteriori complicazioni nella DMD senza causare una risposta immunitaria. In questo studio, introduciamo una combinazione di CRISPR/Cas9 e tecnologie iPSC non integrate per ottenere progenitori muscolari con espressione proteica di distrofina recuperata. In breve, utilizziamo un vettore Sendai non integrato per stabilire una linea iPSC dai fibroblasti dermici dei topimdxi Dmd. Usiamo quindi la strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l’espressione della distrofina attraverso un’unione finale non omologa del gene della distrofina riformulato. Dopo la convalida PCR dell’esaurimento dell’eso23 in tre colonie da 94 colonie iPSC selezionate, differenziamo iPSC in MPC per espressione indotta da Dox (Dox) di MyoD, un fattore chiave di trascrizione che svolge un ruolo significativo nella regolazione della differenziazione muscolare. I nostri risultati mostrano la fattibilità dell’utilizzo della strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l’espressione della distrofina nell’MPC derivato da iPSC, che ha un potenziale significativo per lo sviluppo di future terapie per il trattamento della DMD.
Introduction
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una delle distrofie muscolari più comuni ed è caratterizzata dall’assenza di distrofina, che colpisce 1 di circa 5.000 neonati in tutto il mondo1. La perdita della funzione genica della distrofina si traduce in difetti muscolari strutturali che portano alla degenerazione progressiva delle miofibre1,2. Il sistema di terapia genica mediata da un virus adeno ricombinante (rAAV) è stato testato per ripristinare l’espressione della distrofina e migliorare la funzione muscolare, come la sostituzione genica utilizzando micro-distrofine. Tuttavia, l’approccio rAAV richiede iniezioni ripetute per sostenere l’espressione della proteina funzionale3,4. Pertanto, abbiamo bisogno di una strategia in grado di fornire in modo efficace e permanente l’espressione genica della distrofina nei pazienti con DMD. Il topomdx Dmd, un modello murino per la DMD, ha una mutazione puntiforme nell’esone 23 del gene della distrofina che introduce un codone di terminazione prematura e si traduce in una proteina troncata non funzionale alla mancanza del dominio di legame disproglycan del terminale C. Recenti studi hanno dimostrato l’uso della tecnologia CRISPR/Cas9 per ripristinare l’espressione genica della distrofina mediante una correzione genica accurata o la delezione di esoni mutanti in animali piccoli e grandi5,6,7. Long et al.8 ha riportato il metodo per correggere la mutazione del gene distrofina nella germina murinamdx Dmd mediante la riparazione diretta da omologia (HDR) basata sull’editing del genoma CRISPR/Cas9. El Refaey et al.9 ha riferito che rAAV potrebbe in modo efficiente eccitare l’esone mutante 23 in topi distrofici. In questi studi, i gRNA sono stati progettati negli introni 20 e 23 per causare rotture del DNA a doppio filamento, che hanno parzialmente ripristinato l’espressione della distrofina dopo la riparazione del DNA tramite l’unione finale non omologa (NHEJ). Ancora più eccitante, Amoasii et al.10 hanno recentemente riportato l’efficacia e la fattibilità dell’editing genico CRISPR mediato da rAAV nel ripristino dell’espressione della distrofina nei modelli canini, un passo essenziale nella futura applicazione clinica.
La DMD causa anche disturbi delle cellule staminali11. Per danni muscolari, le cellule staminali muscolari residenziali riforniscono le cellule muscolari morenti dopo la differenziazione muscolare. Tuttavia, i cicli consecutivi di lesioni e riparazione portano ad accorciamento dei telomeri nelle cellule staminali muscolari12, e l’esaurimento prematuro di piscine di cellule staminali13,14. Pertanto, una combinazione di terapia autologa con l’editing del genoma per ripristinare l’espressione della distrofina può essere un approccio pratico per il trattamento della DMD. La tecnologia CRISPR/Cas9 offre la possibilità di generare cellule staminali pluripotenti indotte geneticamente corrette autologie (iPSC) per la rigenerazione muscolare funzionale e prevenire ulteriori complicazioni della DMD senza causare il rigetto immunitario. Tuttavia, gli iPSC hanno un rischio di formazione del tumore, che potrebbe essere alleviato dalla differenziazione dell’iPSC nelle cellule progenitrici miogeniche.
In questo protocollo, descriviamo l’uso del virus Sendai non integrato per riprogrammare i fibroblasti dermici di topimdxi Dmd in iPSC e quindi recuperiamo l’espressione della distrofina con la cancellazione del genoma CRISPR/Cas9. Dopo la convalida della delezione di Exon23 in iPSC mediante genotipizzazione, abbiamo differenziato l’iPSC corretto dal genoma in progenitori miogenici (MPC) tramite la differenziazione miogenica indotta da MyoD.
Protocol
Representative Results
Discussion
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia ereditaria distruttiva e in definitiva fatale caratterizzata da una mancanza di distrofina, che porta ad un’atrofia muscolare progressiva1,2. I nostri risultati dimostrano l’espressione genica distrofina ripristinata nelle cellule progenitrici miogenie derivate da Dmdmdx iPSC dall’approccio della delezione di eon23 mediata da CRISPR/Cas9. Questo approccio presenta tre vantaggi.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang e Weintraub sono stati parzialmente supportati da NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
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