인간 뉴런의 렌 티 바이러스 매개 된 형질 도입을 이용한 타우 응집 연구를 위한 시험관 내 모델

요약

이 프로토콜은 인간 신경 배양이 돌연변이 인간 타우를 코딩 하는 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트와 형질 도입 하는 절차를 자세히 설명 합니다. 형질 도입 배양은 타우 응집 체 및 관련 병 리를 표시 합니다.

초록

단백질 타우의 변종 응집은 병리학 적으로 알 츠 하이 머 병 (AD)을 비롯 한 다 수의 퇴행 성 신경 질환에 관여 한다. 동종 요법의 마우스 모델은 집계 된 타우의 신경 독성 메커니즘을 조사 하기 위한 귀중 한 자원을 제공 했지만, 신경 생리학의 종 간 차이로 인해 마우스 뇌는 적합 하지 않다는 것이 점차 명백 해지고 있습니다. 인간의 상태 모델링. 세포 배양 방법의 진보는 시험관에서 실험적인 사용을 위해 인간적 인 신경 배양을 접근 하 고 신경 치료제의 발달에 원조 했습니다 만들었습니다. 그러나, 인간 신경 세포 배양의 적응에도 불구 하 고, 인간 타우 병의 시험관 내 모델은 아직 널리 이용 되지 않는다. 이 프로토콜은 인간 뉴런이 황색 형광 단백질 (YFP) 리포터에 융합 된 병리학 적 돌연변이 타우에 대 한 코드를 렌 티 바이러스 유래 벡터로 형질 도입 하는 타우 응집의 셀룰러 모델을 기술 한다. 형질 도입 배양은 thioflavin에 대해 긍정적으로 얼룩을 발생 하는 타우 응집 체를 생산 하 고 신경 독성의 마커를 표시 합니다 (예: 감소 된 축 사 길이 및 증가 된 리소 소 양). 이 절차는 인간적 인 tauopathies를 공부 하기를 위한 유용 하 고 비용 효과적인 모형 일 수 있습니다.

서론

소 세관-관련 단백질 타우의 병리학 적 응집은 AD, 전방 측 두 성 치 매 (FTD), 픽의 질병 및 진보적인 수 아 핵 성 마비 (PSP)¹을 포함 하는 많은 신경 변성 질환의 정의 특징 이다. 질병이 없는 상태에서, 타우는 뉴런 축 삭²에서 미세 구 필 라 멘 트에 결합 하 고 안정화 시킵니다. 그러나, 타우의 질병 관련과 인 산화는 타우 응집을 촉진 하 고, 미세 세관에서 해리 되며, 신경 독성³. 집계 된 tau의 독성 효과는 세포내 칼슘의 장애 조절을 초래 하 고, 최종적으로는 세포 사 멸을 유발 하는 콜린 성⁴ 및 glutamatergic 수용 체의 변종 활성화를 수반할 수 있다. 동물 모델에서, 뇌 타우의 감소는 AD 마우스에서 병리학을 향상⁶ 반복적 인 가벼운 외상 성 뇌 손상의 마우스 모델에서⁷.

장착 증거는 마우스 유래 타우의 구조와 결합 친화도가 인간 유래 타우와 구별 된다는 것을 보여주고, 마우스 타우는 인간 tauopath....

프로토콜

1. 미디어 및 시 약의 제조

1. 배양 플레이트에 대 한 지 하 막 매트릭스 코팅을 4°c에서 해 동 (지 하 막 매트릭스를 따뜻하게 하거나 응고 하는 것을 허용 하지 않는다). 1 mL의 알리 쿠오를 만들고-20°c 또는-70 ° c에서 보관 하십시오.
2. 10 µ g/mL에서 멸 균 인산 완충 식 염 액 (PBS)에 기본 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF)를 재구성 하 고 10 µ L 분 취를 만듭니다. 4°c에 보관 하십시오.
3. 미 개봉 500 mL 병 DMEM, 글루타민을 사용 하 여 B27, 5ml(15 ml) 및 페니실린 streptomycin (5ml)을 첨가 하십시오. 이 신경 줄기 세포 (NSC) 매체의 50 mL을 원추형 튜브에 넣고 10 µ L의 10µ을 추가 합니다. NSC (+) bFGF 매체를 4°c에서 보관 한다.
4. (-) BFGF 미디어를 만들려면 1.3 단계에서 설명한 것과 동일한 레시피를 사용 하 되 bFGF 추가 하지 마십시오. 이 매체는 뉴런에 대 한 NSCs를 차별화 하 고 분화 후 신경 배양을 유지 하는 데 사용 됩니다.

2. 렌 티 바이러스 구조

참고: ....

결과

형질 도입 뉴런은 형광을 YFP로 태깅 하였으며, RDLM-형질 도입 배양은 형질 도입 후 응집 체를 표시 하였다. 이러한 개재 물은 thioflavin을 위해 긍정적으로 염색 되었습니다 (그림 1). 그림 1 에서 알 수 있듯이이 프로토콜은 thioflavin 타우 응집 물을 표시 하는 뉴런 문화를 생성 합니다. 초기 실험의 경우, 신경 세포 분화는 배양 물에서 뉴런 특이 적 마커 β-투 불 린 III를 면역 표지 하 여 확인 하는 것이 좋습니다. 중요 하 게는, 형광으로 태그 된 이차 항 체는 YPF (Cy3 예를 들어)와 겹치지 않는 흥분/방출 스펙트럼을 가져야 합니다. 황색 형광 타우 응집 체는 염색의 부재에서 볼 수 있지만, thioflavin 또한 형광 신호가 타우 및 세포 잔해가 아니라 응집 되어 있음을 확인 하기 위해 이미징에 사용 되어야 한다. 추가적으로, 도 1

토론

이 프로토콜은은-얼룩 양성 응집 체 및 thioflavin 양성 신경 섬유의 엉 킴 (NFTs)을 전시 하는 인간 타우 병의 시험관 내 모델의 생성을 설명 합니다. 더욱이, 형질 도입 세포는 형태학 적 결함, 감소 된 synaptogenesis 및 증가 된 리소 소 부피와 같은 타우-유발 병 리를 표시 한다. 이 프로토콜의 주요 이점은 타우 독성의 분석 뿐만 아니라 약물 스크리닝 연구에 사용 될 수 있는 신경 병 증의 접근 및 비용 효율적인 모델을 제공 한다는 것입니다. 이 모델은 인체 타우 병 세포 주를 아직 널리 사용할 수 없고 마우스 유래 뉴런에서 형질 전환 타우를 사용 하 여 동물 사육이 필요 하 고 신경 세포의 차이로 인해 신경 변성 연구에 필요한 물질을 채 웁 니다. 종 사이의 특성.

위에 나열 된 것 외에도이 절차를 성공적으로 수행 하려면 여러 가지 중요 한 단계가 있습니다. 먼저, 바이러스 성 역가가 너무 낮으면 문화가 응집을 형성 하지 않기 때문에 올바른 바이러스.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 배양 접시	Thermofisher	12556002
15 mL 튜브	Biopioneer	CNT-15
16% 파라포름알데히드	Thermofisher	50-980-487
24 웰 배양 플레이트	Thermofisher	930186
50 mL 튜브	Biopioneer	CNT-50
스프레이 병	에 70% 에탄올다양한 출처	NA
B27 보충제	Thermofisher	17504044
기저막 매트릭스 (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
소 혈청 알부민	Sigma	A7906
세포 배양 인큐베이터	다양한 출처	NA
원심분리기	다양한 공급원	NA
글루타민을 함유한 DMEM-F12 배양 배지	Thermofisher	10565042
에탄올(50% 농도 이상)	다양한 공급원	NA
형광 표지된 2차 항체	다양한 공급원, 실험 의존적	NA
형광 현미경	다양한 공급원	NA
유리 커버 슬립	Thermofisher	1254581
유리 슬라이드	Thermofisher	12-550-15
인간 신경 줄기 세포	다양한 소스	NA
렌티바이러스 벡터	다양한 소스	맞춤형 주문
장착 매체	Thermofisher	P36934
N2 보충제	Thermofisher	17502048
페니실린-스트렙토마이신	Thermofisher	15140122
인산염 완충 식염수	Thermofisher	14190250
1차 항체	다양한 공급원, 실험에 의존하는	NA
로킹 또는 회전 플랫폼	다양한 공급원	NA
멸균 세포 배양 후드	다양한 출처	NA
티오플라빈 S	시그마	T1892-25G
트리톤 X-100	써모피셔	BP151-100
수조	다양한 출처	NA