Надежные сравнение уровня белка через ткани и на протяжении развития с использованием стандартизированных количественных западный Blotting
Summary
Этот метод описывает надежных и воспроизводимых подход для сравнения уровня белка в различных тканях и в различные области развития timepoints, с использованием стандартизированных количественных Западный blotting подход.
Abstract
Западный blotting — это метод, который обычно используется для выявления и количественной оценки выражения протеина. С годами эта техника привела к многие успехи в фундаментальных и клинических исследованиях. Однако как с много аналогичные экспериментальные методы, результаты анализов иммуноблоттинга легко влиянием выбор, сделанный в разработке и осуществлении эксперимента. Конкретные хозяйственные белки традиционно используются для нормализации уровня белка для количественной оценки, однако, они имеют ряд ограничений и поэтому чаще критикуют за последние несколько лет. Здесь мы описываем подробный протокол, который мы разработали, чтобы позволить нам для проведения сложных сравнений белка выражение вариации различных тканей, мыши модели (включая модели заболеванием) и развития timepoints. С помощью флуоресцентного белка всего пятно и представляя использование внутренней загрузки стандартных, это можно преодолеть существующие ограничения в количество образцов, которые можно сравнить в рамках экспериментов и систематически сравнивать уровни белка через спектр экспериментальных условиях. Такой подход расширяет использование методов традиционной западной помарки, тем самым позволяя исследователей, чтобы лучше изучить белков через различных тканей и образцы.
Introduction
Западный blotting — это метод, который обычно используется для выявления и количественной оценки выражения протеина, в том числе в гомогенатах ткани или экстрактов. С годами эта техника привела к многие достижения в области фундаментальных и клинических исследований, где она может использоваться как средство диагностики для выявления наличия болезни1,2. Западный blotting был впервые описан в 1979 году как метод для передачи белки от полиакриламидных гелей нитроцеллюлоза листы и впоследствии визуализировать белки, используя вторичные антитела, которые были либо радиоактивно конъюгированных флуоресцеин, помечены или пероксидаза3. Путем разработки коммерчески доступные комплекты и оборудование Западный blotting методы все более стандартизированной и упрощенный с годами. Действительно техника теперь легко осуществляется учеными с различной стола и уровни опыта. Однако как с много аналогичные экспериментальные методы, результаты анализов иммуноблоттинга легко влиянием выбор, сделанный в разработке и осуществлении эксперимента. Важно, таким образом, что доступность стандартизированных западной blotting методы не заслонять необходимость тщательного планирования экспериментальных и дизайн. Экспериментальная соображения включают, но не ограничиваясь, образец подготовки и обработки, отбора и проверки антител для обнаружения протеина и эффективность передачи гель мембраны особенно малых или больших ( 140 кДа) белки4,5,6,,78,9. Качество белка исходного образца играет значительную роль в определении результатов последующих Западный анализ помаркой. Как белка могут быть извлечены из различных образцов и источников, включая линии клеток, тканей животных моделей и ткани трупа человека, последовательность обработки и обработки требуется для получения воспроизводимых результатов. Например когда требуется длительное хранение образцов для извлечения белков, важно понимать, что, хотя белок обычно стабилен при температуре-80 ° C, были различия в стабильности белка извлеченные протеины и нетронутыми тканей при температуре-80 ° C о10. Кроме того чтобы получить воспроизводимые оценки количества белка, последовательной гомогенизации образцов имеет решающее значение. Оптимизации различных лизис буферов и гомогенизации методы (например, по сравнению с автоматизированных методов ручной гомогенизации) могут потребоваться перед началом крупномасштабного количественный эксперимент.
Нормализация стратегий исправить для загрузки и количественной оценки изменчивости белка необходимо получить надежные, количественные результаты экспрессии белков. Уборка номера белков, таких как β-актина, α-тубулина, β-тубулина и Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) традиционно использовались для нормализации уровня белка для количественной оценки. Однако нормализации конкретные хозяйственные белки для целей количественной оценки чаще критикуют за последние несколько лет11,12. Например можно изменить выражение уборки белков через различные этапы развития13,14, через ткани из той же животных4и под различные болезни условия4,15 ,16,17. Таким образом использование конкретных уборки белков ограничивает возможности более сложных сравнений между выражение протеина из различных тканей, в разных timepoints и в различных экспериментальных условиях. Альтернатива для уборки белки для управления для белка загрузки вариации является использование общего белка пятно (TPS) что этикетки и визуализирует всех белков, присутствующих в образце. TPS позволяет сигнал нормализации на основе общего белка нагрузки вместо того, чтобы уровень одного определенного белка и, следовательно, количественная оценка TPS сигнала должна быть сопоставимой и воспроизводимые независимо от экспериментальных условий, образец типа или развития timepoint . Примерами общего белка пятна Пуансо, пятно свободный гели, R-350 Кумасси, рубиново-Sypro, Epicocconone, Amydo черный и Cy5 (обзор в ссылка 18). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и ограничения и выбор метода зависит от времени и средств, а также экспериментальная установка4,18.
Наряду с использованием TPS исправить для загрузки в мембране и количественной оценки изменчивости, необходимо сравнить образцы между различными мембраны, особенно при выполнении анализ выражения протеина крупномасштабных. Однако изменчивость в таких факторов, как привязка эффективности и общей белок интенсивность пятно антитела могут вводить далее изменчивость между образцы протеина, которые анализируются на отдельных гели и мембран. Для надежной количественной оценки в этой ситуации поэтому необходимо ввести еще один шаг нормализации для учета изменчивости между мембраной. Это может быть достигнуто, включая стандарт внутренней нагрузки на каждом отдельно проанализированы мембран, которые является неизменным через эксперименты. Этот стандарт может принимать форму любой белок lysate, который может быть получен в достаточных количествах для использования во всех мембраны, включены в эксперимент. Здесь мы используем lysate мыши мозга (полученные от 5 день старых мышей управления), как легко гомогенизированных мозга и полученный белка lysate содержит значительное количество белка в высокой концентрации. Загрузка внутренний стандарт в трех экземплярах позволяет образцы на отдельных мембраны для нормализации и сравнивается непосредственно.
Здесь мы описываем подробный протокол, который мы разработали, чтобы позволить нам для проведения сложных сравнений белка выражение вариации различных тканей, мыши модели (включая модели заболеванием) и развития timepoints19. Объединив флуоресцентный TPS с использованием внутренней нагрузки стандарта, мы смогли преодолеть существующие ограничения в количество образцов и экспериментальных условий, которые можно сравнивать в рамках одного эксперимента. Такой подход расширяет использование методов традиционной западной помарки, тем самым позволяя исследователей, чтобы лучше изучить белков через различных тканей и образцы.
Protocol
Representative Results
Discussion
С соответствующий экспериментальный дизайн, меры контроля и статистического анализа Западный blotting может использоваться чтобы сделать надежные количественные оценки выражения протеина внутри и между разнообразный спектр биологических образцов. Протокол, который мы описываем в теку?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.J.N.G. поддерживается Уэллком траст (Грант 106098/Z/14/Z). Другие источники финансирования предоставил доверие SMA (SMA Великобритании консорциума; T.H.G. и Y-т. H.), SMA Европы (T.H.G, D.v.D.H. и E.J.N.G.), Эдинбургский университет DTP в точности медицины (T.H.G., л.л. & A.M.M.) и Euan Макдональд центр исследований болезни двигательных нейронов (T.H.G).
Materials
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | — | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. . Applied longitudinal analysis. , (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
