Icke-invasiva strategier för kronisk manipulation av DREADD-kontrollerad neuronal aktivitet
Summary
Här beskriver vi två icke-invasiva metoder för att kroniskt kontrollera neuronala aktivitet med hjälp av chemogenetik hos möss. Ögondroppar användes för att leverera klozapin-N-oxid (CNO) dagligen. Vi beskriver också två metoder för långvarig administrering av CNO i dricksvatten. Dessa strategier för kronisk neuronala kontroll kräver minimal intervention minska djurens stress.
Abstract
Kemogenetiska strategier har vuxit fram som pålitliga verktyg för fjärrstyrning av neuronala aktivitet. Bland dessa, designer receptorer uteslutande aktiveras av designer drugs (DREADDs) har blivit den mest populära kemogenetiska metod som används i modern neurovetenskap. De flesta studier levererar ligand klozapin-N-oxid (CNO) med hjälp av en enda intraperitoneal injektion, som är lämplig för akut aktivering/hämning av den riktade neuronala befolkningen. Det finns dock bara några exempel på strategier för kronisk modulering av DREADD-kontrollerade nervceller, varav de flesta förlitar sig på användning av leveranssystem som kräver kirurgiska ingrepp. Här expanderar vi på två icke-invasiva strategier för att leverera ligand CNO att kroniskt manipulera neurala befolkningen i möss. CNO administrerades antingen genom att använda repetitiva (dagligen) ögondroppar, eller kroniskt genom djurets dricksvatten. Dessa icke-invasiva paradigm resultera i robust aktivering av de designer receptorer som kvarstod i hela CNO behandlingar. De metoder som beskrivs här erbjuder alternativ för kronisk DREADD-medierad kontroll av neuronala aktivitet och kan vara användbart för experiment som syftar till att utvärdera beteendet i fritt rörliga djur, med fokus på mindre invasiva CNO leveransmetoder.
Introduction
Tekniska framsteg inom neurovetenskap har gjort det möjligt för forskarna att exakt identifiera och kontrollera aktiviteten hos vissa neuronala populationer1. Detta har bidragit till att bättre förstå grunden för neuronala kretsar och deras inverkan på djurens beteende, samt, revidera etablerade dogmer2,3. Bland dessa nya verktyg, optogenetiska och kemogenetiska strategier har haft en djupgående inverkan inte bara på kvaliteten på upptäckter utan också på hur experiment utformas och utformas4. I det nuvarande manuskriptet fokuserar vi på chemogenetiska strategier för att kontrollera aktiveringen av nervceller via konstruerade receptor-ligand-strategier. Designer receptorer uteslutande aktiveras av designer drugs (DREADDs) utgör en av de mest populära kemogenetiska verktyg för fjärrstyrning av neuronala aktivitet, som granskats av Roth 20165. DREADDs utnyttja modifierade muskarinacetylkolinreceptorer som är specifikt aktiveras av en inert ligand, klozapin-N-oxid (CNO)6.
De flesta studier använder CNO administreras av intraperitoneal (i.p.) injektioner, som effektivt styr doseringen och tidpunkten för konstruerade receptorer aktivering på ett akut sätt. Men när repetitiva eller kronisk DREADD aktivering krävs, användning av flera i.p. injektioner blir omöjlig. För att lösa detta problem, olika strategier för kronisk CNO leverans har rapporterats, inklusive implanterade minipumpar7 och intrakraniella kanyl8,9. Till olika grader, alla dessa strategier orsakar djuren stress och smärta10, och kräver en kirurgisk intervention som också kan ha en direkt inverkan på beteendemässiga svar som ska testas11. Här beskriver vi tre icke-invasiva strategier för kronisk CNO-leverans.
För detta ändamål var möss stereotaxically injiceras i hippocampus med en Adeno-associerade virus (AAV) kodning en konstruerad version av excitatoriska M3 muskarina receptor (hM3Dq) som när den aktiveras av ligand CNO leder till burst-liknande bränning av nervceller6. Det visades tidigare att en enda ögondroppe som innehåller CNO effektivt kan framkalla en robust aktivering av DREADD-uttrycker nervceller12. Här beskriver vi en modifierad metod för repetitiv leverans av ögondroppar. För att uppnå kronisk och varaktig kontroll av designerreceptorer, beskriver vi nästa en icke-invasiv strategi för att leverera CNO till möss genom dricksvattnet. Slutligen beskriver vi ett alternativt paradigm för att leverera CNO i dricksvatten under ett begränsat tidsfönster. Möss rörelseaktivitet, liksom dryckesbeteende och konsumtionen av söta kalori lösningar, är oftast begränsade till den mörka delen av ljus/mörker cykel13,14. Därför antog vi ett protokoll baserat på musens preferens för sackaros. Genom att mäta induktionen av den omedelbara tidiga genen c-FOS i AAV-infekterade celler, som en avläsning för neuronala aktivering12,15, fann vi att dessa CNO leverans strategier kraftfullt aktivera dreadd-kontrollerade neuroner över utökade Varaktigheter.
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADDs har vuxit fram som en populär och effektiv strategi för att på distans manipulera neuronala aktivitet17. Utformningen av alternativa strategier för CNO leverans kommer i stort sett öka spektrumet av alternativ tillgängliga för specifika experimentella inställningar. Dessutom, icke-invasiva strategier för leverans av CNO minimera eventuella feltolkningar av resultaten genom att minska negativa biverkningar som direkt kan påverka djurens hälsa. Här beskrev vi två icke-invasiva s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av interna forskningsprogram vid National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02). Vi skulle vilja tacka stöd av NIMH IRP gnagare beteendemässiga kärna (ZIC MH002952).
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. . Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
