Síntese e caracterização de nanopartículas de silício poroso de Fusogenic para a entrega do Oligonucleotide Functionalization
Summary
Demonstramos a síntese de nanopartículas de silício poroso fusogenic para entrega efectiva do oligonucleotide in vitro e in vivo. Nanopartículas de silício poroso são carregadas com siRNA para formar o núcleo, que é revestido por fusogenic lipídios através da extrusão para formar o reservatório. Direcionamento functionalization moiety e caracterização de partículas estão incluídos.
Abstract
Com o advento da terapia gênica, tornou-se o desenvolvimento de um sistema de entrega eficaz em vivo do nucleotide-carga de importação paralela. Nanopartículas de silício poroso de Fusogenic (F-pSiNPs) recentemente demonstraram alto vivo em eficácia devido a sua alta do oligonucleotide carregar a capacidade e a via de absorção celular exclusivo que evita a endocitose de silenciamento do gene. A síntese de F-pSiNPs é um processo de várias etapa que inclui: (1) carregamento e selagem de payloads do oligonucleotide nos poros do silicone; (2) revestimento simultâneo e dimensionamento de lipídios fusogenic em torno dos núcleos de silício poroso; e (3) conjugação de direcionamento de peptídeos e de lavagem para remover o excesso do oligonucleotide, detritos de silício e peptídeo. Uniformidade de tamanho da partícula é caracterizada pela difusão dinâmica da luz, e sua estrutura casca-núcleo pode ser verificada por microscopia eletrônica de transmissão. A absorção de fusogenic é validada por carregar um lipofílico tingir, 1, 1′-dioctadecyl-3,3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), para a fusogenic lipídica e tratá-la às pilhas in vitro para observar para coloração contra a membrana plasmática endocítica localizações. As direcionamento e in vivo eficácias silenciar do gene anteriormente foram quantificadas em um modelo do rato de pneumonia de Staphylococcus aureus , em que o peptídeo alvo é esperado para ajudar o F-pSiNPs a casa para o local da infecção. Além da sua aplicação na infecção por S. aureus , o sistema F-pSiNP pode ser usado para entregar qualquer do oligonucleotide para a terapia de gene de uma vasta gama de doenças, incluindo doenças auto-imunes, câncer e infecções virais.
Introduction
Terapia genética modula a expressão de genes específicos para obter um resultado terapêutico. Inúmeras ferramentas para modulação de genes foram descobertas e estudadas, incluindo ácido ribonucleico interferência (RNAi) usando oligonucleotídeos (por exemplo, curto interferência do RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmídeo5,6, nucleases (por exemplo, dedo de zinco, TALENS)7,8e CRISPR/Cas9 sistemas9,10. Enquanto mecanismo de cada ferramenta de ação é diferente, todas as ferramentas devem alcançar o citoplasma da célula ou o núcleo para ser ativo. Como tal, embora estas ferramentas têm comprovado para induzir um efeito significativo na modulação de expressão gênica in vitro, a eficácia in vivo sofre entraves extracelulares e intracelulares. Devido ao fato de que as ferramentas são de origem biológica, muitas enzimas e sistemas de limpeza existem em nosso corpo que têm a capacidade de degradar ou remover as moléculas estrangeiras11. Mesmo no caso que as ferramentas atingem a célula-alvo, eles sofrem de endocitose; um modo de captação celular que encapsula e prende as ferramentas em vesículas ácidas do estômago-como que degradam ou expulsar as ferramentas fora da célula. De fato, estudos têm mostrado que nanopartículas de lipídios são endocytosed através de macropinocitose, da qual cerca de 70% do siRNA são exocytosed das células dentro de 24h de captação12,13. A maior parte do restante siRNA é degradada através da via lisossomal, e em última análise, apenas 1-2% de siRNA que inicialmente entra na célula com as nanopartículas alcançar CDDP fuga potencialmente submeter-se a RNAi13,14 .
Recentemente desenvolvemos a nanopartículas de silício poroso de fusogenic (F-pSiNPs) que têm um núcleo de siRNA-carregado composto de nanopartículas de silício poroso e um fusogenic lipídica shell15. Os F-pSiNPs apresenta três grandes vantagens sobre outros sistemas de entrega convencional do oligonucleotide: (1) um lipídio fusogenic revestimento que permite que as partículas de ignorar a endocitose e entregar a carga inteira diretamente no citoplasma celular (contra o 1-2% alcançado por partículas de endocytosed13,14) (Figura 1); (2) alto carregamento em massa de siRNA no pSiNPs (> 20% em peso em comparação com 1-15% em peso por sistemas convencionais)15, que rapidamente degradar no citoplasma (uma vez que as partículas do núcleo derramou o revestimento lipídico através de captação de fusogenic) para liberar o siRNA; e (3) visando a conjugação de peptídeo para orientação seletiva para desejado tipos de células in vivo.
O sistema F-pSiNP demonstrou silenciamento eficácia significativa do gene (> 95% in-vitro; > 80% in vivo) e o subsequente efeito terapêutico em um modelo de mouse fatal de S. aureus pneumonia; os resultados dos quais foram anteriormente publicados15. No entanto, a estrutura complexa do sistema F-pSiNP requer manipulação delicada e otimização de aperfeiçoá-lo para gerar nanopartículas uniformes e estáveis. Assim, o objetivo deste trabalho é apresentar um protocolo completo, bem como estratégias de otimização para a síntese, functionalization e caracterização de F-pSiNPs para ser usado no alvo entrega de siRNAs para efeito silencioso potente gene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Síntese de nanopartículas de silício poroso é mostrado na Figura 5. O passo fundamental na síntese de fusogenic pSiNPs está na etapa de carregamento (etapa 3). Se as nanopartículas fusogenic são agregar pós-síntese (Figura 3), o motivo pode ser devido ao seguinte: (1) estoque de cloreto de cálcio não foi homogênea preparado, assim passo 3.1.2 deve ser cuidadosamente seguido ou refinado; ou (2) a relação de pSiNP: siRNA: CaCl2 ou a conce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health, através de contrato # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
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