로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화
Summary
이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.
Abstract
심근 재생을 위한 세포 치료 효과 향상에 있는 결정적인 요인은 세포 생착 비율을 안전하고 효율적으로 증가하는 것입니다. Y-27632는 로-관련, 코일 코일 함유 단백질 키나아제(RhoA/ROCK)의 매우 강력한 억제제이며 해리-유도 세포 세포 세포 사멸(anoikis)을 예방하는 데 사용됩니다. 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs+RI)에대한 Y-27632 전처리가 급성 심근경색(MI)의 마우스 모델에서 세포 생착율 향상을 초래한다는 것을 입증한다. 여기서, 우리는 Y-27632를 가진 hiPSC-CM 분화, 정화 및 세포 전처리의 완전한 절차, 뿐만 아니라 생성된 세포 수축, 칼슘 과도 측정 및 마우스 MI 모델로의 이식에 대해 설명합니다. 제안된 방법은 세포 생착 속도를 현저하게 증가시키는 간단하고 안전하며 효과적이며 저렴한 방법을 제공한다. 이 방법은 세포 이식 효율을 더욱 향상시키기 위해 다른 방법과 함께 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 심장 질환의 메커니즘에 대한 연구에 유리한 기반을 제공합니다.
Introduction
줄기 세포 기지를 둔 치료는 MI 1에 기인한 심장손상을 위한 처리로 상당한 잠재력을 보여주었습니다. 차별화된 hiPSCs의 사용은 hiPSC-CMs2의 무한한 공급원을 제공하고 획기적인 치료법의 신속한 발전을 위한 문을 엽니다. 그러나, 이식된 세포의 심각하게 낮은 생착 율의 도전을 포함하여 치료 번역에 많은 한계가 남아 있습니다.
트립신과 세포를 해리하는 것은 anoikis를시작합니다 3, 이는 이 세포가 허혈성 심근과 같은 가혹한 환경에 주입되면 가속되는, 저산소 환경은 세포 죽음을 향한 과정을 가속화. 나머지 세포의, 큰 비율은 혈 류로 이식 사이트에서 밖으로 세척 하 고 주변에 걸쳐 확산. 주요 apoptotic 경로 중 하나는 RhoA/ROCK통로 4. 이전 연구에 기초하여, RhoA/ROCK통로는 세포 기능 장애7,8을담당하는 액틴 세포골격 조직5,6을조절한다. 이 록 억제제 Y-27632는 체세포 및 줄기세포 해리 및 패시징 시 널리 사용되며, 세포 부착을 증가시키고 세포 세포 사멸을 감소시키는데9,10,11. 본 연구에서, Y-27632는 세포 생착 속도를 증가시키기 위한 시도로 이식 전에 hiPSC-CM을 치료하는 데 사용된다.
열 충격 및 지하 막 매트릭스 코팅(12)과 같은세포 생착 속도를 개선하기 위한 여러 가지 방법이 수립되었다. 이러한 방법 외에도, 유전 기술은 또한 심근세포 증식(13)을 촉진하거나 비근신세포(14)로 역전시킬 수 있다. 생명공학적 관점에서, 심근세포는 이식효율을향상시키기 위해 생체 재료 스캐폴드상에 시드된다(15). 불행히도, 이러한 방법의 대부분은 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 반대로, 여기에 제안 된 방법은 간단하고 비용 효율적이며 효과적이며 이식 전 기저 치료뿐만 아니라 다른 기술과의 활용에도 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구의 주요 단계는 순수한 hiPSC-CM을 획득하고, Y-27632 전처리를 통해 hiPSC-CM의 활성을 개선하고, 마지막으로 정확한 양의 hiPSC-CM을 마우스 MI 모델로 이식하는 것을 포함합니다.
여기서 해결된 주요 이슈는 우선 포도당 없는 정제 방법19를 최적화하고 새로운 효율적인 정화 시스템을 구축했다는 것입니다. 시스템 절차에는 세포 해리 효소를 적용하고, 젤라?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 조셉 C. 우 박사에게 감사드립니다 (스탠포드 대학) 친절하게 Fluc-GFP 구조와 박사 얀웬 리우 우수한 기술 지원을 제공. 이 연구는 국립 보건원 에서 지원되는 HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (J.Z.), HL121206A1 (L.Z.), R56 보조금 HL142627 (미국 하트 협회) 16SDG30410018, 버밍엄 학부 개발 보조금에서 앨라배마 대학 (W.Z.에).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
References
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