שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז
Summary
בפרוטוקול זה, אנו להפגין ולפרט כיצד להשתמש בתאי גזע המושרה האדם pluripotent לבידול וטיהור, ועוד, על איך לשפר את היעילות השתלת שלה עם Rho-הקשורים החלבון קינאז מעכבי טיפול מקדים במודל אוטם שריר הלב של העכבר.
Abstract
גורם מכריע בשיפור האפקטיביות של הטיפול הסלולארי להתחדשות שריר הלב היא להגדיל בביטחה וביעילות את שיעור התיאום בין התאים. Y-27632 הוא מעכב חזק מאוד של Rho-הקשורים, סליל המכיל חלבון קינאז (RhoA/רוק) והוא משמש כדי למנוע אפופטוזיס המושרה תא (anoikis). אנו מדגימים כי Y-27632 מראש עבור האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע שמקורם בגוף (היפנוטית-CMs+ RI) לפני תוצאות השרשה תא שיפור שיעור השיפור במודל העכבר של אוטם שריר הלב חריפה (MI). כאן, אנו מתארים הליך מלא של בידול היפנוסי-CMs, טיהור, תא טיפול מקדים עם Y-27632, כמו גם את התכווצות התאים המתקבל, מדידות חולף סידן, ו השתלת לתוך מודלים MI של העכבר. השיטה המוצעת מספקת שיטה פשוטה, בטוחה, אפקטיבית ובעלות נמוכה אשר מגדילה באופן משמעותי את קצב התיאום בין התאים. שיטה זו לא ניתן להשתמש רק בשילוב עם שיטות אחרות כדי לשפר עוד יותר את יעילות השתלת התא, אך גם מספק בסיס נוח לחקר המנגנונים של מחלות לב אחרות.
Introduction
תאי גזע מבוססי טיפולים הראו פוטנציאל ניכר כטיפול בנזקי לב שנגרמו על ידי MI1. השימוש הבדיל hiPSCs מספק מקור בלתי נדלה של היפנואס-CMs2 ופותח את הדלת להתפתחות מהירה של טיפולים פריצת דרך. עם זאת, נותרו מגבלות רבות לתרגום תרפויטי, כולל האתגר של השיעור הנמוך החמור ביותר של תאים מושתלים.
הנתק תאים עם טריפסין יוזם anoikis3, אשר מואצת רק פעם אחת תאים אלה מוזרק לסביבות קשות כמו שריר הלב, שם הסביבה ארוי מאיצה את הקורס לקראת מוות התאים. מבין התאים הנותרים, מדובר בפרופורציה גדולה החוצה מאתר ההשתלה למחזור הדם ומתפשט ברחבי הפריפריה. אחד המסלולים מפתח השבץ הוא מסלול RhoA/סלע4. בהתבסס על המחקר הקודם, מסלול rhoa/סלע מווסת את ארגון אקטין השלד של הגוף5,6, אשר אחראי על תפקוד התאים7,8. הסלע מעכב Y-27632 נמצא בשימוש נרחב במהלך הדיסוציאציה של תאי גזע ומלא, כדי להגדיל את הדבקה התא ולהפחית אפופטוזיס תא9,10,11. במחקר זה, Y-27632 משמש לטיפול היפרsc-CMs לפני השתלת בניסיון להגדיל את שיעור התא המקביל.
מספר שיטות שמטרתן לשפר את שיעור התיאום בין התאים, כגון שוק חום וציפוי מטריצות ממברדת מרתפים12, הוקמו. מלבד שיטות אלה, טכנולוגיה גנטית יכולה גם לקדם את התפשטות הקרדיוציט13 או תאים שאינם שריר הלב לתוך הקרדיוציטים14. מנקודת המבט הביולוגית, הקרדיוציטים. מתשתלת בתוך ביופיגום כדי לשפר את יעילות ההשתלה15 למרבה הצער, רוב השיטות האלה הן מסובכות ויקרות. להיפך, השיטה המוצעת כאן היא פשוטה, חסכונית ויעילה, והיא יכולה לשמש כטיפול בסיס לפני ההשתלה, כמו גם בקוניוגציה עם טכנולוגיות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים המרכזיים של מחקר זה כוללים השגת היפוך טהור-CMs, שיפור הפעילות של היפרsc-CMs דרך Y-27632 pretreatment טיפול, ולבסוף, שתילת כמות מדויקת של היפנוsc-CMs לתוך מודל MI של העכבר.
הנושאים המרכזיים שנדונו כאן היו כי, תחילה, אנו אופטימיזציה שיטות הטיהור ללא גלוקוז19 והקימו מערכת טיהו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד ר ג’וזף ג. וו (אוניברסיטת סטנפורד) לספק באדיבות את המבנה Fluc-GFP וד ר יאנון ליו לקבלת סיוע טכני מעולה. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי של בריאות RO1 מענקים HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (כדי J.Z.), ו HL121206A1 (כדי L.Z.), ו R56 מענק HL142627 (כדי W.Z.), מענק האיגוד האמריקני לפיתוח מדען האגודה 16SDG30410018, ואת אוניברסיטת אלבמה ב ברמינגהאם מענק פיתוח הפקולטה (כדי W.Z.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
