Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase
Summary
In dit protocol demonstreren en uitwerken we over het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen voor cardiomyocyt differentiatie en zuivering, en verder, over hoe de transplantatie-efficiëntie te verbeteren met de met Rho geassocieerde proteïnekinaseremmer voor behandeling in een muis myocardinfarct model.
Abstract
Een cruciale factor in het verbeteren van de effectiviteit van cellulaire therapie voor myocardiale regeneratie is het veilig en efficiënt verhogen van het engraftment percentage van de cel. Y-27632 is een zeer krachtige remmer van Rho-geassocieerde, coiled-Coil-bevattende proteïne kinase (RhoA/ROCK) en wordt gebruikt om dissociatie-geïnduceerde cel apoptosis (anoikis) te voorkomen. We tonen aan dat Y-27632 voor behandeling voor menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs+ RI) voorafgaand aan implantatie resulteert in een cel engraftment tarief verbetering in een muismodel van acuut myocardinfarct (MI). Hier beschrijven we een complete procedure van de hiPSC-CMs-differentiatie, zuivering en celvoorbehandeling met Y-27632, evenals de resulterende celcontractie, calcium Transient-metingen en transplantatie in muis MI-modellen. De voorgestelde methode biedt een eenvoudige, veilige, effectieve en goedkope methode die het percentage van de cel-engraftment aanzienlijk verhoogt. Deze methode kan niet alleen worden gebruikt in combinatie met andere methoden om de efficiëntie van de celtransplantatie verder te verbeteren, maar biedt ook een gunstige basis voor de studie van de mechanismen van andere hartziekten.
Introduction
Stamcel therapieën hebben een aanzienlijk potentieel aangetoond als een behandeling van hart schade veroorzaakt door MI1. Het gebruik van gedifferentieerde hiPSCs biedt een onuitputtelijke bron van hiPSC-CMs2 en opent de deur voor de snelle ontwikkeling van baanbrekende behandelingen. Er blijven echter veel beperkingen voor therapeutische vertalingen bestaan, waaronder de uitdaging van het ernstig lage engraftment percentage van geïmplanteerde cellen.
Dissocierende cellen met trypsine initieert anoikis3, die alleen wordt versneld als deze cellen worden geïnjecteerd in ruwe omgevingen zoals het ischemische myocardium, waarbij de hypoxische omgeving de koers versnelt naar celdood. Van de overgebleven cellen wordt een groot deel van de implantatieplaats in de bloedbaan weggespoeld en verspreid over de periferie. Een van de belangrijkste apoptotische trajecten is de RhoA/ROCK pathway4. Op basis van eerder onderzoek, de rhoa/Rock traject regelt de actine cytoskelet organisatie5,6, die verantwoordelijk is voor de cel dysfunctie7,8. De rotsremmer Y-27632 wordt veel gebruikt tijdens somatische en stamcel dissociatie en passaging, om de celhechting te verhogen en cel apoptosis9,10,11te verminderen. In deze studie wordt Y-27632 gebruikt voor de behandeling van hiPSC-CMs voorafgaand aan transplantatie in een poging om het celengraftment tarief te verhogen.
Er zijn verschillende methoden vastgesteld voor het verbeteren van het engraftment percentage van de cel, zoals warmte schok en kelder membraan matrix coating12. Afgezien van deze methoden, genetische technologie kan ook bevorderen hartspier proliferatie13 of omgekeerde nonmyocardiale cellen in hartspier14. Vanuit het oogpunt van biotechniek worden cardiomyocyten geënt op een biomateriale steiger om de transplantatie-efficiëntie te verbeteren15. Helaas zijn de meeste van deze methoden ingewikkeld en kostbaar. Integendeel, de hier voorgestelde methode is eenvoudig, kostenefficiënt en effectief, en kan worden gebruikt als een basale behandeling voor transplantatie, evenals in conjugatie met andere technologieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste stappen van deze studie zijn het verkrijgen van pure hiPSC-CMs, het verbeteren van de activiteit van hiPSC-CMs door middel van Y-27632 voor behandeling, en tot slot het verplanten van een precieze hoeveelheid hiPSC-CMs in een muis MI-model.
De belangrijkste kwesties die hier aan de orde waren, waren dat we eerst de glucose vrije zuiverings methoden19 hebben geoptimaliseerd en een nieuw efficiënt zuiveringssysteem hebben opgezet. De systeem procedure om…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Joseph C. Wu (Stanford University) voor de vriendelijke levering van de Fluc-GFP Construct en Dr. Yanwen Liu voor uitstekende technische assistentie. Deze studie wordt gesteund door de National Institutes of Health RO1 Grants HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (to J.Z.), en HL121206A1 (to L.Z.), en een R56 Grant HL142627 (to W.Z.), een Amerikaanse hart associatie wetenschapper ontwikkelings subsidie 16SDG30410018, en de Universiteit van Alabama in Birmingham Faculty ontwikkelings subsidie (naar W.Z.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
