Drosophila cellinjer är viktigt reagenser för både grundläggande och biomedicinsk forskning. Den här artikeln innehåller protokoll för upptining, subculturing och Frysförvaring av vanliga Drosophila cellinjer att hjälpa forskare att innefattar användning av reagenserna i sin forskning.
Det finns för närvarande över 160 olika Drosophila cellinjer som distribueras av Drosophila genomik Resource Center (DGRC). Med genomet engineering förväntas antalet roman cellinjer öka. DGRC syftar till att bekanta forskare med använda Drosophila cellinjer som en experimentell tool att komplettera och driver deras forskningsprojekten. Procedurer för att arbeta med en mängd Drosophila cellinjer med tydliga kännetecken som, inklusive protokoll för upptining, odling och bevarandet cellinjer. Viktigast av allt, visar denna publikation de bästa metoderna som krävs för att arbeta med Drosophila cellinjer att minimera risken för föroreningar från oavsiktlig mikroorganismer eller andra cellinjer. Forskare som blivit förtrogna med dessa förfaranden kommer att kunna gräva i de många program som använder Drosophila odlade celler inklusive biokemi, cellbiologi och funktionsgenomik.
Användning av Drosophila odlade celler kompletterar Invivo flyga genetisk analys och fungerar som en primär förfrågan verktyg för att hantera många grundläggande biologiska frågor1,2,3. Drosophila cell lines erbjuder unika homogen populationer av celler som härrör från olika vävnad källor med olika genetiska bakgrunder. Cellinjer som passar många applikationer inklusive transgena genuttryck, genomik, transkriptomik, proteomik, metabolomik, hög genomströmning RNA interferens (RNAi) skärmar, cellbiologi och mikroskopi. Ännu viktigare, underlättar karakterisering av de omedelbara temporal Svaren till kända stimuli av Drosophila cellodling. Drosophila cellkultur är dessutom mottagliga för CRISPR-Cas9 genomet redigering, vilket gör det relativt enkelt att skapa nya cellinjer med specifika genomet ändringar4,5,6, 7.
Drosophila genomik Resource Center (DGRC) fungerar som en lagringsplats och distribution center för Drosophila cellinjer. En av DGRC mål är att hjälpa medlemmar av forskarsamhället i använda Drosophila cell kultur resurser. Denna artikel presenterar grundläggande protokoll för hantering av Drosophila cellinjer. Det kompletterar befintliga resurser för att hjälpa forskarna att bli bekväm med att hantera Drosophila cellkulturer och uppnå en nivå av självständighet i deras experiment1,2,8,9 ,10.
De vanligaste Drosophila cellinjer är: Schneider fodrar11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake imaginal skiva och centrala nervsystemet (CNS) fodrar13,14, Milner laboratorium imaginal skiva linjer 15, de vuxna cystor cell linjer16,17och de Ras linjer18 (tabell 1). Schneider och Kc167 raderna är allmänt allrengöringsmedel cellinjer för användning i biokemi, rekombinant transgena genuttryck och omvänd genetiska skärmar. Mitsubishi/Miyake laboratorium (ML) raderna härleddes från larval imaginal skivor eller centrala nervsystemet (CNS) och de har varit användbar för studier relaterade till neurosecretion, transkription förordning och RNA bearbetning. Milner (CME) skiva raderna har varit viktiga för att studera signaltransduktion. De fGS/OSS cellinjer som härstammar från mutant vuxen äggstockar kvar viktiga reagenser att studera effekterna av icke-kodande små RNA-biologi i bakteriecellen underhåll och differentiering17,19. Slutligen är de Ras linjerna unik eftersom dessa cellinjer som härstammar från embryon som ectopically uttrycker det Ras onkogen. De har transkriptionell undertecknandet av föregångare muskelceller och uttrycker aktiva piRNA maskiner20. Senaste översiktsartiklar och bokkapitel täcka tillämpningar av dessa populära cellinjer med mer detaljer2,3,9.
Alla dessa cellinjer kan subkultiveras och fryst. I området i närheten finns det liten men viktig olika krav för hur varje cellinje upprätthålls och förberett för frysförvaring. Exempelvis kräver olika cellinjer olika media och kosttillskott (tabell 1). Linjerna också variera i ytan följsamhet egenskaper, morfologier (figur 1 och figur 2), genotyp och fördubbling tid (tabell 2). Vi presenterar grundläggande protokoll och markera skillnaderna för hantering av de olika allmänt använda Drosophila cellinjer.
Drosophila cellkulturer är primära reagenser för hög genomströmning cellbaserade skärmar. Deras användning också kompletterar Invivo genetisk forskning med en homogen population av celler som är lämplig för biokemi, snabb testning av transgena konstruktioner innan injicera in flugor, cellbiologi, Mikroskopi och mer nyligen somatisk genetisk manipulationer av genomet redigering1,2,3,8,9,10.
Livskraft och återvinning av frysta Drosophila celler är känslig för drastiska svängningar även vid låga temperaturer. DGRC lagrar frysta cellinjer i den flytande fasen av N2 (-196 ° C) och transporterar dem i torr-is (-78,5 ° C). Fryst ampuller som har transporterats i torris bör inte överföras tillbaka till vätska N2 eller en-80 ° C frys för förvaring. Istället bör de frusna cellerna vara tinade, nämligen på en hög cell densiteten så snart som möjligt vid ankomsten (protokoll avsnitt 1) och odlade för de avsedda ändamålen (protokoll avsnitt 3). Om cellinjer inte utnyttjas omedelbart för experiment, cellen linjer bör vara fryst tillstånd (protokollenheten 6) tills de är redo för användning.
Vissa cellinjer, såsom raderna ML-BG2-c2 och Ras måste flera dagar att återhämta sig från effekterna av att återupplivas av frysförvarade staten. En betydande mängd cellulära skräp medföljer dessa cellinjer som de första dagarna efter upptining. Lämnas ostörda, kommer att cellerna återhämta sig och föröka. Många Drosophila cellinjer på DGRC har anpassats till växa i M3 baserade media22. För cellinjer som är långsamma att återhämta sig från effekterna av upptining, vara användning av konditionerat media användbar. Konditionerat media sannolikt innehåller tillväxtfaktorer som utsöndras av celler i media som kan uppmuntra återvinning och spridning av celler efter upptining.
Cellinjer följer i allmänhet en stereotypa tillväxtkurva bestående av en eftersläpning fas, exponentiell fas, plateau fas och en försämring fas. Många Drosophila cellinjer föröka i log-fas tillväxt när de odlas på en densitet mellan 1 x 106 och 1 x 107 celler/mL vid 25 ° C. Det är viktigt att cellinjer är anpassade så att de är alltid i exponentiella tillväxtfasen.
Sammanflödet av en kultur, uttryckt i procent, beskriver det tillväxt yta som täcks av celler. Cell sammanflödet för en cell fodrar beror på dess cell form och storlek. Skilda cellinjer har olika morfologier och följsamhet egenskaper. Som ett resultat, kanske olika cellinjer på ungefär liknande confluence oerhört distinkta cell densiteten (figur 1). Kultur sammanflödet kanske inte en idealisk indikator för passaging Drosophila cellkulturer eftersom Drosophila cellinjer fortsätta att föröka antingen genom att stapla ovanpå varandra som foci eller i suspension även efter tillväxt ytan har varit omfattas (figur 1). Användare erfarna med specifika cellinjer kan dock ofta använda sammanflödet som en snabb visuell guide för när att subkultur.
Det är möjligt att odla Drosophila linjer på omgivande RT mellan 19−25 ° C, rekommenderas det inte eftersom omgivande temperaturvariationer kan påverka andelen spridning. Användning av en dedikerad 25 ° C inkubator rekommenderas. Inkubatorn för Drosophila cellkulturer behöver inte underlätta CO2 gasutbyte eftersom Drosophila cell kulturmassmedia inte använder CO2 för buffring. Fuktigheten inuti inkubatorn för odling av cellinjer är en viktig faktor för att inte förbises när odling av celler i plattor. Beroende på vilken typ på inkubatorn och arbetsmiljö, kan det nödvändigt att placera en bägare sterilt vatten inuti inkubatorn. För att minimera media avdunstning, Använd slutna T-kolven eller förvara kultur plattor i en tätt försluten plastbehållare medan inuti inkubatorn.
Det är viktigt att utveckla ett schema för subculturing Drosophila cellinjer. För att uppskatta tillväxt takt och övervaka samstämmigheten, är det praktiskt att subkultur vid en även geometriska förhållande (split baserat på 1:2, 1:4, 1:8). Kc167 celler på 8 x 106 celler/mL 10 mL konfluenta tallrik kan exempelvis delas upp på 1:8 förhållandet att uppnå en sådd täthet på 1 x 106 celler/mL (1,25 mL cellsuspension utspädd till 8,75 mL färsk media). I 72 h förväntas Kc167 kulturer att föröka till en densitet på 8 x 106 celler/mL, ges dess fördubbling tid av 24 h. Delningsfaktorn bestäms därför att underlätta en bekväm subkultur rutin av upp till två gånger i veckan, att säkerställa att cellerna odlas alltid i sin exponentiella log fas av tillväxt. Detta möjliggör ett regelbundet schema för subculturing cellerna så att tiden till sammanflödet är varken för kort eller för lång. Om tiden till sammanflödet är för kort, är cellerna subkultiveras på en lägre cell densiteten (högre split ratio). Likaså, om tiden för att nå sammanflödet är för lång, cellerna är subkultiveras på en högre cell densiteten (lägre split ratio). Det är viktigt att notera att de flesta Drosophila cellinjer är mycket känslig för lågt tätheter (< 1 x 105 celler/mL), i vilka celler knappast föröka sig och kan så småningom dö.
Drosophila cellinjer varierar i tillväxt egenskaper och morfologi. Cellinjer med distinkta egenskaper kanske därför behandlas annorlunda. De flesta Drosophila cellinjer är semi vidhäftande. Vid lägre celldensitet, de följer starkare tillväxt ytan och som kulturen blir konfluenta, cellerna blir mindre vidhäftande och enkelt lossa. Denna gradvisa förändring i cell följsamhet underlättar lätt subculturing av mest använda Drosophila cellinjer (Schneider, Kc linjer, imaginal skiva och CNS linjer) eftersom det tillåter operatören att enkelt fördela media över den cell enskiktslager rubba dem från tillväxt ytan när kulturen är tät. För linjer som är ytan anhängare som de kvinnliga könsceller-stammen/cystor somatiska slida (fGS/OSS) och Ras linjer, det är viktigt att Inkubera cellerna i trypsin under en kort tid till stöd i lossa cellerna från tillväxt ytan.
Media tillägg för de flesta Drosophila cellinjer inkluderar fetalt kalvserum (FCS). Insulin och vuxen fluga extrakt (FEX) krävs för vissa specifika rader. FEX innehåller odefinierad beståndsdelar tillväxten av specifika larval imaginal skiva linjer och de vuxna cystor cellinjer. DGRC förbereder, och gör tillgängliga vuxna FEX härrör från 1 vecka gamla Oregon-R-modENCODE flugor (RRID: BDSC_25211) i 2,5 mL och 10 mL alikvoter. DGRC innehåller också instruktioner för liten skala FEX förberedelse på sin webbplats . FEX förberedelse, dock är tidskrävande och kräver en stor mängd vuxna flugor.
Frysförvaring av Drosophila cellinjer sparar tid och reagenser för underhåll av cellinjer inte i omedelbar användning. Frysförvaring uppnås genom långsamt fryser ner cellerna (-1 ° C/min) till-80 ° C i ett medium innehållande DMSO, en cryoprotective agent. Det långsamma kyla steget är avgörande för framgångsrik frysförvaring. I-80 ° C frys kyls ampullen av celler med en hastighet av-1 ° C/min när den placeras i en frysning behållare fylld med isopropanol. Start vid 25 ° C omgivningstemperatur, tar det upp till 2 h för temperaturen i de ampuller till-80 ° C. Det rekommenderas att lämna de ampuller att frysa över natten.
Fryst ampuller måste sedan snabbt överföras till den flytande fasen av kväve för långvarig lagring. Vid rumstemperatur, cryovial kommer att värma snabbt vid cirka 10 ° C/min och lönsamhet kommer att äventyras på över-50 ° C23. För att hålla överföringen snabb, hantera ampuller i små partier att minimera exponeringen för omgivningstemperatur. Alternativt placera den frysta cryovials på torris samtidigt förbereda för deras överföring till vätska N2. Om flytande kväve inte är tillgänglig, kan cellerna lagras i-80 ° C frys, men med risk för betydande försämring med tiden.
Cell densiteten är avgörande för framgångsrik frysförvaring och efterföljande återupplivandet av cellinjer. I allmänhet nya cell linjer bör frysas för att skapa ursprungliga frysa (1−3 ampuller) så snart som ett överskott av celler blir tillgängliga. När cellinje har varit ytterligare odlade stabilt, bör ett fryst lager av 10−20 ampuller skapas. Detta lager är sedan Tinas att leta efter frysningen cell återvinning och livskraft, varefter det sprids för experimenterande eller ersätta beståndet när antalet fryst lager ampuller understiger fem. Slutligen är det viktigt att validera att de upptinade cellerna behåller egenskaperna av dess föräldrabeståndet cellinjer är känt att utvecklas3,24.
Avslutningsvis presenterar denna artikel en primer för att arbeta med Drosophila cellkulturer av lämna grundläggande uppgifter om de olika linjerna, bästa praxis och audiovisuella protokoll för grundläggande hantering av Drosophila cellinjer. Denna tillgänglig resurs är tänkt att smidigt lätta introduktion till arbetar med odlade Drosophila celler och komplettera befintliga utbildning guider på alla forskningslaboratorium.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar National Institutes of Health (Award NIH P40OD010949) och forskarvärlden för att utnyttja de olika D. melanogaster DNA/vector/cell resurserna kurator på DGRC.
100 mm tissue culture plates | Corning | 430167 | Subculturing |
25 cm2 T-flask | Corning | 430168 | Subculturing |
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank | Taylor-Wharton | 35HCB-11M | Cryopreservation |
Automated Cell counter | BIO-RAD | TC20 | Counting |
Bactopeptone | BD BioSciences | 211677 | Medium additions |
Counting Slides | BIO-RAD | 145-0011 | Counting |
Cryovial 1 mL | Greiner | 123263 | Cryopreservation |
DMSO | Sigma Aldrich | D5879 | Cryopreservation |
Freezing Box | Nalgene | 5029-0909 | Cryopreservation |
Freezing Container | Fisher Scientific | 15-350-50 | Cryopreservation |
Hematocytometer | Fisher Scientific | #0267110 | Counting |
Human Insulin | Millipore Sigma | I9278 | Medium additions |
Hyclone CCM3 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30061.03 | Medium |
Hyclone Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | Medium additions |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1149 | Medium additions |
L-Glutathione reduced | Millipore Sigma | G6013 | Medium additions |
Potassium Bicarbonate | Millipore Sigma | 237205 | Medium additions |
Select Yeast Extract | Millipore Sigma | Y1000 | Medium additions |
Shields and Sang's M3 Insect medium | Millipore Sigma | S8398 | Medium |
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Subculturing |
Trypan Blue (0.4%) | BIO-RAD | 145-0013 | Counting |