Denne protokollen tar sikte på å generere direkte omprogrammeres interneurons in vivo, ved hjelp av et AAV-basert virus system i hjernen og en FLEX synapsin-drevet GFP reporter, som gjør det mulig for celle identifisering og videre analyse in vivo.
Konvertering bosatt glia i hjernen til funksjonelle og under type-spesifikke neurons in vivo gir et skritt fremover mot utvikling av alternative celle erstatning terapier samtidig skape verktøy for å studere celle skjebne in situ. Hittil har det vært mulig å få neurons via in vivo omprogrammering, men den presise fenotype av disse neurons eller hvordan de modne ikke har blitt analysert i detalj. I denne protokollen, beskriver vi en mer effektiv konvertering og celle-spesifikk identifisering av in vivo omprogrammeres neurons, ved hjelp av en AAV-basert viral vektor system. Vi tilbyr også en protokoll for funksjonell vurdering av omprogrammeres cellenes neuronal modning. Ved å injisere flip-forbruker (FLEX) vektorer, som inneholder omprogrammering og synapsin-drevet reporter gener til bestemte celletyper i hjernen som fungerer som mål for celle omprogrammering. Denne teknikken gjør det mulig for enkel identifisering av nylig omprogrammeres neurons. Resultatene viser at de oppnådde omprogrammeres neurons funksjonelt modne over tid, motta Synaptic kontakter og vise elektrofysiologisk egenskaper av ulike typer interneurons. Ved hjelp av transkripsjon faktorer Ascl1, Lmx1a og Nurr1, de fleste av de omprogrammeres cellene har egenskaper av fast-skyter, parvalbumin-inneholdende interneurons.
Det overordnede målet med denne metoden er å effektivt konvertere hjernen bosatt glia in vivo i funksjonell og under type-spesifikke neurons som parvalbumin-uttrykker interneurons. Dette gir et skritt fremover mot utviklingen av en alternativ celle erstatning terapi for hjernesykdommer uten behov for en eksogene celle kilde. Det skaper også et verktøy for å studere celle skjebne brytere in situ.
Hjernen har bare en begrenset kapasitet for å generere nye neurons. Derfor, i nevrologiske sykdommer, er det behov for eksogene celle kilder for hjernen reparasjon. For dette har ulike kilder til celler blitt utsatt for intens forskning gjennom årene, inkludert celler fra primær vev, stilk cellen-avledet celler og omprogrammeres celler1,2,3. Direkte omprogrammering av fastboende hjerneceller i neurons er en nylig tilnærming som kan gi en attraktiv metode for hjernen reparasjon som den bruker pasientens egne celler for å generere romanen neurons inne i hjernen. Hittil har flere rapporter vist i vivo omprogrammering gjennom viral vektor levering i hjernen4,5,6,78,9 i ulike hjerneregioner som cortex, ryggmargen, striatum og mellomhjernen5,10,11, så vel som i intakt og lesioned Brain5,8,11,12. Både hemmende og eksitatoriske neurons har blitt oppnådd4,8, men den presise fenotype eller funksjonaliteten til disse cellene har ennå ikke blitt analysert i detalj.
I denne protokollen beskriver vi en mer effektiv omprogrammering og celle spesifikk identifisering av in vivo omprogrammeres neurons. Vi tilbyr en protokoll for funksjonell vurdering av neuronal modning og fenotype karakterisering basert på funksjonalitet og immunhistokjemiske egenskaper.
Vi brukte en grobunn-induserbart AAV vektor og en GFP reporter å identifisere in vivo omprogrammeres neurons. Dette valget av viral vektorer har fordelen av å infisere både dele og ikke-splitte celler i hjernen, øke antall målrettede celler, som et alternativ til bruk av retrovirus. En Nevron-spesifikk synapsin-drevet FLEX reporter (GFP), gjorde oss i stand til å spesifikt oppdage den nylig genererte neurons. Tidligere studier har brukt under type-spesifikke arrangører for in vivoomprogrammering, som også tillater uttrykk for omprogrammering gener og journalister i bestemte celletyper. Imidlertid krever at metoden ytterligere identifisering av omprogrammeres neurons av postmortem analyse av co-uttrykk for reporter og neuronal markører. Bruken av en Nevron-spesifikk reporter, slik som den som er beskrevet her, åpner for en direkte identifisering. Dette gir en direkte bevis på en vellykket konvertering og tillater en live celle identifikasjon som er nødvendig for patch-Clamp elektrofysiologi.
In vivo direkte omprogrammering kan oppnås ved hjelp av AAV FLEX vektorer i grobunn-uttrykker musen stammer. Det er viktig å merke seg at forskjellene mellom mus stammer med hensyn til omprogrammering effekt er observert. For in vivo-omprogrammering i striatum har NG2-grobunn vist seg å være mer effektiv sammenlignet med andre stammer. Før du begynner å bruke en ny dyr belastning, er det viktig å sjekke musen leverandøren retningslinjer angående grobunn uttrykk over tid, som en alder av dyr ofte påvirker spesifisitet av dette proteinet uttrykket. I våre studier, dyr eldre enn 12 uker ble ikke brukt til in vivo omprogrammering som det var en risiko for grobunn uttrykk i celler enn NG2 glia. Den konstante tilstedeværelsen og overvåking av kontroll dyr injiseres bare med Synapsin-FLEX-GFP konstruere anbefales. Dette gjør det mulig å overvåke dyrene for GFP-positive celler som ikke skal være til stede hvis ingen omprogrammering gener (ALN) brukes.
For å identifisere de nylig omprogrammeres neurons, en Nevron-spesifikk identifisering metode som beskrevet i denne protokollen er av største betydning. Dette gir en riktig identifisering og forskjellsbehandling av omprogrammeres neurons fra endogene omkringliggende celler som er av særlig relevans når omprogrammering i en homotopic region.
Det er også viktig å målrette riktig struktur for viral injeksjon. Derfor er stereotaxic kirurgi for viral injeksjon viktig og må nærmet med nøyaktighet, spesielt når målretting mindre strukturer i hjernen.
Vi har tidligere vist11 at det ikke er pålitelig å forutsi utfallet av in vivo-omprogrammering basert på in vitro omprogrammering eksperimenter ved bruk av de samme omprogrammering faktorene. Alle faktorer av interesse må derfor testes in vivo. I våre hender gir mange forskjellige faktor kombinasjoner den samme under typen av neurons (dvs. interneurons11 in vivo) til tross for at disse genene har vært innblandet i utviklingen av andre neurons.
Hel celle patch klemme for omprogrammeres neurons er en delikat teknikk og vev behandling er viktig for et godt utfall. Med iskald Krebs-oppløsning forbedres vevs kvaliteten. Også lappet neurons må behandles nøye. Selv om modning og fenotypiske identiteten til omprogrammeres neurons kan bli noe vurdert ved hjelp av hele cellen patch klemme, disse cellene er ikke helt sammenlignbare med sine endogene kolleger. Flere typer analyser, for eksempel sekvens sekvenser (for eksempel RNA-sekvenser), bør brukes for å bekrefte omprogrammeres celle identitet ytterligere.
Teknikken beskrevet her er kan vurderes for utvikling av fremtidige terapier der neuronal utskifting er nødvendig i hjernen. Selv om in vivo omprogrammering fortsatt er på et tidlig stadium og oversettelsen til mennesker ennå ikke er forutsett, kan denne teknikken gi en metode for å vurdere eksogene gen funksjon i hjernen og studere celle modning i vivo.
The authors have nothing to disclose.
Marcella Birtele har blitt finansiert av European Union Horizon 2020 program (H2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie nyskapende trening nettverk og Grant Agreement no. 676408. Daniella Rylander Ottosson har blitt finansiert av Swedish Research Council (2017-01234).
REAGENTS FOR AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
pAAV-CA-FLEX | AddGene | 38042 | |
Ascl1 | AddGene | 67291 | NM_008553.4 |
Lmx1a | AddGene | 33013 | NM_0033652.5 |
Nurr1 | AddGene | 35000 | NM_013613.2 |
GFP-syn | AddGene | 30456 | |
LoxP (FLEX) sequence 1 | GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga |
||
LoxP (FLEX) sequences 2 | tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC |
||
pDP5 | Plasmid Factory | PF435 | |
pDP6 | Plasmid Factory | PF436 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61965026 | |
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
HEK293 cells | Thermo Fisher Scientific | 85120602-1VL | |
Flasks | BD Falcon | 10078780 | 175 cm2 |
Tris H-CL | Sigma Aldrich | 10812846001 |
For TE buffer use 10 mM, pH 8.0; for lysis buffer use 50mM, pH 8.5; for IE buffer use 20 mM, pH 8.0; for elution buffer use 20 mM, pH 8.0
|
EDTA | EDTA: Invitrogen | EDTA: AM9260G |
For TE buffer use 1 mM EDTA
|
Ultrapure water |
see Ultrapure water system
|
||
CaCl2 | SigmaAldrich | C5080 | 2.5 M |
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
FOR HBS use 140 mM; for Lysis Buffer use 150 mM; for IE buffer use 15 mM; for elution buffer use 250 mM
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G |
For lysis Buffer: 1 mM
|
Ultracentrifuge sealing tubes | Beckman Coulter | Quick-Seal® Polypropylene Tube | |
OptiPrep™ Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556-250ML | |
10-mL syringe-18G needle | BD | 305064 | |
Laboratory glass bottles | VWR | ? | |
Anion exchange filter | PALL laboratory | MSTG25Q6 |
Acrodisc unit with Mustang Q membrane
|
Centrifugal filter unit | Merck | Z740210-24EA |
Amicon Ultra-4 device
|
Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits | Thermo Fisher Scientific | A33073 | |
Na2PO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | 15 mL |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352196 | |
Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | Corning 352070 | |
Glass Vials | Novatech | 30209-1232 |
CGGCCTCAGFGAGCGA
|
Forward Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
|
||
Reverse Primer for Inverted Terminal Repeat (ITR) sequence |
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG
|
||
5´FAM / 3´BHQ1 probe | Jena Bioscience | ||
0.22 mm filter | Merck | SLGV004SL | Millex-GV filter |
EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION | |||
Freezer -20 °C | |||
Freezer -80 °C | |||
Fridge +4 °C | |||
AAV viral room | |||
Ultrapure Water system | Merck | Milli-Q® IQ 7000 | |
Vortex mixer | VWR | 444-0004 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540 EL | |
Polymerase Chain Reaction (PCR) | BioRad | C1000 Touch Thermal Cycler | |
Quantitative PCR (qPCR) | Roche | LightCycler® 480 System | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST16 | |
Water Bath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
ANIMAL MODEL | |||
NG2-Cre mice | Jackson | NG2-CrexB6129, Stock #008533 | |
REAGENTS FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN | |||
Water | |||
Saline | Apoteket AB | 70% | |
Ethanol | Solveco | ||
Isolfurane | Apoteket AB |
Dilute to 1% solution with warm water.
|
|
Virkon | Viroderm | 7511 | |
Pentobarbital | Apoteket AB | P0500000 |
i.p. for terminal procedure at the dose of 60 mg/ml.
|
Sucrose | Merck | S0389-500G | |
Trypan Blu | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Retrobeads | Lumafluor | R170 | |
Buprenorphine | Apoteket AB | ||
EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN |
From RSG Solingen.
|
||
Scissors | VWR | 233-1552 | From Biochem. |
Tweezers | VWR | 232-0007 | |
Forcep | VWR | 232-0120 | |
Scalpel holder | VWR | RSGA106.621 | Number 20. |
Scalpel | VWR | RSGA106.200 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Europe | 51500D | |
Mouse ear bars | Stoelting Europe | 51648 | 5 ul |
Syringe with Removable needle | Hamilton Company | 65 |
0,75 inner diameter and 1.5 outer diameter.
|
Glass capilaries | Stoelting | 50811 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Dental drill | Agnthos AB | 1464 | |
Shaver | Agnthos AB | GT420 | |
Isoflurane Chamber and pump | Agnthos AB | 8323101 | 2 mL |
Syringes | Merck | Z118400-30EA | 25G |
Needles | Merck | Z192414 Aldrich | |
Mouse and neonatal rat adaptor for stereotaxic fram | Stoelting | 51625 | |
Heating pad | Braintree scientific, inc | 53800M |
From Covidien 2187.
|
Cotton gauze | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
Rubber tube | Elfa Distrelec | HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150 | |
Cotton swabs | Fisher Scientific | 18-366-473 | |
REAGENTS FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
NaH2PO4-H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
MgCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
CaCl2-6 H2O | Sigma-Aldrich | C8106 | |
MgSO4-7 H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 |
see Ultrapure Water system
|
Ultrapure Water | Prepare 1 or 2M. | ||
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
K-D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 Sigma | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 Sigma | |
KOH- Hepes acid (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Mg2ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
Na3GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Picrotoxin | Merck | P1675 Sigma | |
CNQX | Merck | C239 Sigma | |
Ice | |||
EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS | |||
Borosilicate glass pipette | Sutter Company | B150-86-10 | |
Glass capillary puller | Sutter company | P-1000 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000 S | |
WaterBath | Thermo Fisher Scientific | TSGP02 | |
Clampfit software | Molecular Devices | ||
Multiclamp software | Molecular Devices | ||
REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY |
Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin.
|
||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 |
Use at a concentration of 0.1%.
|
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 |
Donkey.Use at a concentration of 1 : 400.
|
Serum | Merck Millipore | S30-100ML |
Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
|
4′,6-Diamidino-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 |
1: 600 in KPBS-T.
|
streptavidin- Cy3 | Thermo Fisher Scientific | 434315 | 1:5000, rabbit. |
Anti-GAD65/67 | Abcam | 1:2000, mouse. | |
Anti-PV | Sigma | P3088 | 1:200, goat. |
Anti-Chat | Merk | AB143 | 1:5000, rabbit. |
Anti-NPY | Immunostar | 22940 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | 1:1000, chicken. |
Anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
Mounting solution | Merck | 10981 |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading
|
OCT | Agar Scientific | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
Distilled water | |||
Anti-freeze solution | Tissue Pro Technology | AFS05-1000N, 1000 mL/ea. | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 laser scanning confocal microscope. | |
Prism | GraphPad | ||
Microtome | Leica | SM2010R |