Tensione di integrina e cellulare forza alla risoluzione di Submicron con un sensore di tensione integrativa di imaging

Summary

Tensione di integrina svolge i ruoli importanti in varie funzioni cellulari. Con un sensore di tensione integrativa, integrina tensione è calibrato con sensibilità picoNewton (pN) e ripreso a risoluzione di submicron.

Abstract

Molecolare tensione trasmessa dal ligando integrinico obbligazioni è il segnale meccanico fondamentale nella via dell'integrina che gioca un ruolo importante in molte funzioni cellulari e comportamenti. Per calibrare e integrina tensione della battuta con forza elevata sensibilità e risoluzione spaziale, abbiamo sviluppato un sensore di tensione integrativa (ITS), un sensore di tensione fluorescente basati sul DNA. L'ITS viene attivato per essere flourescente se sostenere una tensione molecolare, così convertire forza segnale fluorescente a livello molecolare. La soglia di tensione per l'attivazione di ITS è accordabile nell'intervallo di pN 10 – 60 che ben copre la gamma dinamica della tensione delle integrine in cellule. Su un substrato innestato con un ITS, la tensione di integrin di cellule aderenti è visualizzata tramite fluorescenza ed imaged a risoluzione di submicron. L'ITS è anche compatibile con formazione immagine strutturale delle cellule in cellule vive e cellule fissate. L'ITS è applicato con successo per lo studio della contrazione delle piastrine e migrazione cellulare. Questa carta in dettaglio la procedura per la sintesi e l'applicazione dell'ITS nello studio della forza cellulare integrina-trasmessa.

Introduction

Le cellule si basano sulle integrine di aderire ed esercitano forze cellulare alla matrice extracellulare. Trasmissione di adesione e forza di integrina-mediata delle cellule sono cruciali per cella diffusione^1,2, migrazione^3,4e sopravvivenza^5,6,7. A lungo termine, integrina biomeccanico segnalazione influenza anche cellula proliferazione^8,9,10 e differenziazione

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso (IACUC, 8-16-8333-I) della Iowa State University e istituzionali Animal Care.

1. sintesi del sensore tensione integrativa

1. Personalizzare e ordinare ssDNAs (Vedi la Tabella materiali).
   Nota: Le sequenze di ssDNA sono come segue. Il filo superiore è /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. I fili inferiori sono come segue.
   12 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/
   23 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT/ CCC
   33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
   43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
   pN 54 ITS....

Results

Con l'ITS, la mappa di tensione integrina dei keratocytes di pesce è stata catturata. Dimostra che un keratocyte migra e genera tensione integrina alle due tracce di forza (Figura 2A). La risoluzione della mappa forza è stata calibrata per essere 0,4 µm (Figura 2B). Integrina alta tensione si concentra sul margine posteriore (Figura 3A). L'ITS Mostra anche diversi modelli specifici di cellule diverse.......

Discussion

L'ITS è un altamente accessibile ma potente tecnica per cellulare mappatura in termini sia di sintesi e di applicazione della forza. Tutti i materiali pronti, l'ITS può essere sintetizzato entro 1 giorno. Durante gli esperimenti, sono necessari solo tre passaggi di rivestimento superficiale prima della placcatura di cella. Recentemente, abbiamo ulteriormente semplificato la procedura di rivestimento per un passo collegando direttamente il suo di albumina di siero bovino, che consente di adsorbimento fisico diretto dell'I.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA-biotina	Sigma-Aldrich	A8549
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	434301
filamento superiore DNA	Tecnologie DNA integrate	N/A	Progettato dal cliente. La sequenza del DNA è mostrata nella sezione PROTOCOLLO
filamento inferiore DNA	Integrated DNA Technologies	N/A	progettato dal cliente. Le sequenze di DNA sono mostrate nella sezione PROTOCOLLO.
sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	A39268
Peptide ciclico RGD con un gruppo amminico	Peptidi Internazionale	PCI-3696-PI
IMDM	ATCC	‎
FBS	ATCC	302020
Penicillina	gibco	15140122
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706
200 uL piastra di Petri	Cellvis	D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	Spettrometro N/A
SE410 Unità di elettroforesi proteica verticale raffreddata ad aria alta	Hoefer	SE410-15-1.5	Dispositivo per elettroporesi
Linea cellulare CHO-K1	ATCC	CCL-61
Linea cellulare NIH/3T3	ATCC	CRL-1658
Anticorpo anti-vincolina	EMD Millipore	90227	Anticorpo primario per l'immunocolorazione della vincolina
Anticorpo secondario superclonale IgG di capra (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A28175	Anticorpo secondario per l'immunocolorazione con vinculina
Alexa Fluor 647 Falloidina	Invitrogen	A22287
Eclipse Ti	Nikon	N/A	microscopio