Modèle de xénogreffe hétérogène dérivé par le patient du cancer du pancréas à l'aide de larves de poisson zèbre comme hôtes pour l'évaluation comparative des médicaments
Summary
Ce protocole décrit des procédures d’optimisation dans un modèle de xénogreffe de tumeur à base de virus à double fluorescence utilisant le poisson zèbre larvaire comme hôtes. Ce modèle hétérogène de xénogreffe imite la composition tissulaire du microenvironnement pancréatique de cancer in vivo et sert d’outil plus précis pour évaluer des réponses de drogue dans les modèles personnalisés de zPDX (xénogreffe patient-dérivé de zèbre).
Abstract
Le xénogreffe de tumeur patient-dérivé (PDX) et le xénogreffe de tumeur cell-dérivé (CDX) sont des techniques importantes pour l’évaluation préclinique, le guidage de médicament et les recherches fondamentales de cancer. Des générations de modèles PDX chez les souris hôtes traditionnelles prennent beaucoup de temps et ne fonctionnent que pour une petite proportion d’échantillons. Récemment, le poisson zèbre PDX (zPDX) est apparu comme un système d’accueil unique, avec les caractéristiques de petite échelle et de haute efficacité. Ici, nous décrivons une méthodologie optimisée pour produire un modèle de xénogreffe de tumeur à double fluorescence-étiqueté pour l’évaluation comparative de chimiothérapie dans les modèles de zPDX. Les cellules tumorales et les fibroblastes ont été enrichis à partir de tissus du cancer du pancréas fraîchement récoltés ou congelés à différentes conditions de culture. Les deux groupes cellulaires ont été étiquetés par lentivirus exprimant des protéines fluorescentes vertes ou rouges, ainsi qu’un gène anti-apoptose BCL2L1. Les cellules transfectées ont été prémélangées et co-injectées dans le poisson zèbre larvaire à 2 dpfs qui a ensuite été élevé dans un milieu E3 modifié à 32 oC. Les modèles de xénogreffe ont été traités par des drogues de chimiothérapie et/ou l’inhibiteur de BCL2L1, et les viabilities des cellules de tumeur et des fibroblastes ont été étudiées simultanément. En résumé, ce protocole permet aux chercheurs de générer rapidement une grande quantité de modèles zPDX avec un microenvironnement hétérogène de tumeur et fournit une fenêtre d’observation plus longue et une quantitation plus précise dans l’évaluation de l’efficacité des candidats-médicaments.
Introduction
L’oncologie de précision vise à trouver les stratégies thérapeutiques les plus bénéfiques pour chaque patient1. Actuellement, de nombreux modèles précliniques tels que la culture primaire in vitro, la culture organoïde in vitro2, et les xénogreffes dérivées du patient (PDX) chez la souris avant ou après la culture organoïde sont proposés pour le diagnostic et pour dépister/évaluer le potentiel choix thérapeutiques3. Le modèle PDX généré par l’injection de cellules cancéreuses primaires humaines chez des souris immunodéprimées est l’un des outils les plus prometteurs pour le dépistage personnalisé des médicaments en oncologie clinique3,4. Contrairement à la lignée cellulaire cultivée in vitro, les modèles PDX préservent habituellement l’intégrité et l’hétérogénéité de l’environnement tumoral in vivo, imitant mieux la diversité et les caractéristiques idiosyncrasiques de différents patients tumoraux, et donc, peuvent prédire le résultats médicaux potentiels des patients4. Cependant, la génération de modèles PDX chez la souris nécessite des échantillons de patients de haute qualité et des mois de temps pour recueillir suffisamment de cellules et de modèles pour des expériences multigroupes, et les compositions cellulaires/génétiques du xénogreffe peuvent dériver de celles de l’original biopsiedu patient. Le taux de réussite pour l’établissement du modèle PDX souris est également faible, ce qui rend difficile d’être largement mis en œuvre dans la pratique clinique. Pour les patients porteurs de cancers rapidement progressés comme le cancer du pancréas, ils peuvent ne pas être en mesure d’obtenir des informations précieuses à partir des expériences PDX à temps.
Au cours des dernières années, le poisson zèbre a été signalé pour être des hôtes potentiels non seulement CDX (tumeur dérivée de cellules xénogreffe) modèles, mais aussi pDX modèles5,6,7,8,9, 10. En tant qu’animal modèle vertébré, le poisson zèbre présente des similitudes suffisantes avec les mammifères en génétique et en physiologie, avec deux avantages importants : la transparence et la petite taille11. Le poisson zèbre est également très fécondé, et des centaines de larves consanguines peuvent être obtenues en quelques jours à partir d’une seule paire d’adultes12. Plusieurs études ont utilisé le poisson zèbre pour générer à la fois des modèles transgéniques et xénogreffes des maladies cancéreuses13,14. Comparé aux xénogreffes de souris, les xénogreffes de poisson zèbre permettent le suivi à la résolution simple de cellules. Une certaine quantité de tissus humains est capable de générer des centaines de modèles de poissons zèbres PDX (zPDX), alors que peut seulement être suffisant pour générer un couple de souris Modèles PDX15,16. En outre, les larves de poisson zèbre à 2-5 dpf développent déjà des systèmes circulatoires complets et des organes métaboliques tels que le foie et les reins, mais pas le système immunitaire17, tandis que le sac jaune restant est un milieu 3D naturel, idéal pour le dépistage des médicaments, médicament tests de résistance et observations de migration tumorale6,18,19,20,21.
Avec une tentative ultime d’utiliser zPDX comme une plate-forme de dépistage / test pour une utilisation clinique, ici, nous décrivons une proposition optimisée pour le modèle zPDX du cancer du pancréas, qui permet l’évaluation in vivo candidat médicament dans un court laps de temps en utilisant moins de cellules à moindre coût. Par rapport aux références précédentes sur zPDX6,9,10, nous avons introduit plusieurs optimisations pour rendre le système plus faisable et fiable pour le diagnostic clinique personnalisé: 1) pré-triant différentes cellules groupes dans les tissus tumorales primaires et la stabilisation des cellules primaires pendant une semaine avant d’autres expériences; 2) l’étiquetage des cellules humaines et l’amélioration de la viabilité cellulaire dans le xénogreffe par la modification génétique basée sur le lentivirus; 3) l’optimisation de l’état de culture de poisson zèbre dans les suppléments de nutriment (glucose et glutamine) et la température ; 4) quantifier les réponses de drogue de différents types de cellules d’une manière comparative. Nous avons également apporté des modifications à la solution d’injection en ajoutant plusieurs matériaux supplémentaires. Au total, ces améliorations offrent la possibilité de générer rapidement un xénogreffe plus patient-comme dans les hôtes de poissons zèbres qui peuvent être utilisés comme un outil fiable pour évaluer la réponse des médicaments candidats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les deux modèles PDX et CDX sont des plates-formes vitales dans le domaine de la biologie tumorale22, et l’étape critique d’une transplantation inter-espèces réussie est d’améliorer la survie du xénogreffe. Récemment, certaines études ont montré que l’expression transitoire de BCL2L1 (BCL-XL) ou BCL2 peut améliorer considérablement la viabilité des cellules souches embryonnaires humaines chez les hôtes de souris sans affecter l’identité cellulaire et les …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China 81402582, Natural Science Foundation of Shanghai 12DZ295100, 14YF1400600 et 18ZR1404500
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
