Patient-derived heterogena xenograft modell av pankreascancer med Zebrafish larver som värdar för jämförande drog bedömning
Summary
Detta protokoll beskriver optimerings procedurer i en virusbaserad Dual Fluorescence-märkt tumör xenograft modell med larv zebrafiskar som värdar. Denna heterogena xenograft modell härmar vävnads sammansättningen av pankreascancer mikromiljö in vivo och fungerar som ett mer exakt verktyg för att bedöma läkemedelssvar i personlig zPDX (Zebrafish patient-derived xenograft) modeller.
Abstract
Patient-derived tumörxenograft (PDX) och cell-derived tumörxenograft (CDX) är viktiga tekniker för preklinisk bedömning, medicinering vägledning och grundläggande cancer forskningar. Generationer av PDX-modeller i traditionella värd möss är tidskrävande och fungerar bara för en liten del av proverna. Nyligen har zebrafiskar PDX (zpdx) vuxit fram som ett unikt värdsystem, med kännetecken av småskalig och hög verkningsgrad. Här beskriver vi en optimerad metod för att generera en dual Fluorescence-märkt tumör xenograft modell för jämförande kemoterapi bedömning i zPDX modeller. Tumörceller och fibroblaster var berikad från nyskördade eller frysta pankreascancer vävnad vid olika odlingsförhållanden. Båda cellgrupperna var märkta av lentivirus uttrycker grönt eller rött fluorescerande proteiner, samt en anti-apoptos gen BCL2L1. De transfekterade cellerna var färdigblandade och co-injiceras i 2 DPF larv zebrafiskar som sedan föds upp i modifierad E3 medium vid 32 ° c. Xenograft-modellerna behandlades med cytostatika och/eller BCL2L1-hämmare, och viabiliteterna hos både tumörceller och fibroblaster undersöktes samtidigt. Sammanfattnings, detta protokoll gör det möjligt för forskare att snabbt generera en stor mängd zPDX modeller med en heterogen tumör mikromiljö och ger en längre observationfönster och en mer exakt kvantifiering vid bedömningen av effektiviteten i läkemedelskandidater.
Introduction
Precision Oncology syftar till att hitta de mest fördelaktiga terapeutiska strategierna för individuell patient1. För närvarande, många prekliniska modeller såsom in vitro-primär kultur, in vitro Organoid kultur2, och patient-härledda xenograft (pdx) i möss före eller efter Organoid kultur föreslås för diagnos och att skärmen/bedöma den potentiella terapeutiska val3. PDX-modell som genereras genom injektion av humana primära cancerceller i immunkomprometterade möss, är ett av de mest lovande verktygen för individanpassad läkemedels screening i klinisk onkologi3,4. Till skillnad från odlade cellinjer in vitro, PDX modeller brukar bevara integriteten och heterogenitet i in vivo tumör miljön, bättre imitera mångfalden och idiosynkratiska egenskaper hos olika tumör patienter, och därför kan förutsäga potentiella medicinska resultat av patienter4. Generering av PDX-modeller hos möss kräver dock högkvalitativa patientprover och månader för att samla in tillräckligt med celler och modeller för flera grupp experiment, och xenografens cellulära/genetiska sammansättningar kan glida från de ursprungliga patientensbiopsi. Framgången för att etablera möss PDX modellen är också låg, vilket gör det svårt att i stort sett genomföras i klinisk praxis. För de patienter som bär snabbt framskridit cancerformer som pankreascancer, de kanske inte kan få värdefull information från PDX experiment i tid.
Under de senaste åren, zebrafiskar har rapporterats vara potentiella värdar för inte bara CDX (cell-derived tumör xenograft) modeller, men också PDX modeller5,6,7,8,9, 10. som ryggradsdjur är zebrafiskar tillräckligt likheterna med däggdjur i både genetik och fysiologi, med två betydande fördelar: transparens och små i storlek11. Zebrafish är också mycket Fecundity, och hundratals inavlade larver kan erhållas inom några dagar från ett enda par vuxna12. Flera studier har använt zebrafiskar för att generera både transgena och xenograft modeller av cancersjukdomar13,14. Jämfört med möss xenograft, zebrafiskar xenograft tillåta spårning vid enkel cell upplösning. En viss mängd mänskliga vävnader kan generera hundratals zebrafiskar PDX-modeller (zpdxs), medan kan bara vara tillräckligt för att generera ett par möss PDX modeller15,16. Förutom, zebrafiskar larverna på 2-5 DPF redan utveckla kompletta cirkulationssystem och metabola organ såsom lever och njure, men inte immunförsvaret17, medan den resterande äggula SAC är en naturlig 3D-medium, perfekt för Drug screening, drog motstånds prov och tumör migration observationer6,18,19,20,21.
Med ett ultimat försök att använda zPDX som en screening/testplattform för klinisk användning, här, beskriver vi ett optimerat förslag för zPDX modell för cancer i bukspottskörteln, vilket gör att in vivo läkemedelskandidat bedömning inom en kort tid med färre celler till lägre kostnader. Jämfört med tidigare hänvisningar om zpdx6,9,10, introducerade vi flera optimeringar för att göra systemet mer genomförbart och tillförlitligt för klinisk personlig diagnos: 1) försortera olika cell grupper i den primära tumör vävnader och stabiliserande primära celler för en vecka innan ytterligare experiment; 2) märkning av mänskliga celler och förbättra cellernas lönsamhet i xenograft via lentivirusbaserad genetisk modifiering; 3) optimera zebrafiskar kultur skick i både näring kosttillskott (glukos och glutamin) och temperatur; 4) kvantifiering av läkemedels svaren från olika celltyper på ett jämförande sätt. Vi har också gjort ändringar i injektionslösningen genom att tillsätta flera kompletterande material. Sammantaget ger dessa förbättringar möjlighet att snabbt generera en mer patientliknande xenograft i zebrafiskar värdar som kan användas som ett tillförlitligt verktyg för att bedöma svaret av läkemedelskandidater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både PDX och CDX modeller är vitala plattformar inom tumörbiologi22, och det kritiska steget i en lyckad Inter-Art transplantation är att förbättra överlevnaden av xenograft. Nyligen, vissa studier har visat att övergående uttryck av BCL2L1 (BCL-XL) eller BCL2 kan avsevärt förbättra livskraften hos mänskliga embryonala stamceller i möss värdar utan att påverka cell identiteter och öden23 , 24 <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina 81402582, Natural Science Foundation i Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 och 18ZR1404500
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
