Меланома пациента-производные Ксенотрансплантат Модель
Summary
Пациент полученных ксенотрансплантат (PDX) модели более надежно резюмировать меланомы молекулярных и биологических особенностей и более прогностические терапии ответ по сравнению с традиционными пластиковых тканей культуры на основе анализов. Здесь мы описываем наш стандартный операционный протокол для создания новых моделей PDX и характеристики/экспериментирования существующих моделей PDX.
Abstract
Накопленные данные свидетельствуют о том, что молекулярные и биологические свойства отличаются в клетках меланомы, выращенных в традиционных двухмерных сосудах культуры тканей по сравнению с in vivo у пациентов с людьми. Это связано с узким местом выбора клональных популяций клеток меланомы, которые могут сильно расти в пробирке при отсутствии физиологических условий. Кроме того, ответы на терапию в двухмерных культурах тканей в целом не точно отражают реакцию на терапию у пациентов с меланомой, при этом большинство клинических испытаний не показывают эффективность терапевтических комбинаций, которые доказали свою эффективность в Пробирке. Хотя ксенотрансплантация клеток меланомы на мышей обеспечивает физиологический контекст виво отсутствует в двухмерных анализов культуры тканей, меланомы клеток, используемых для прививки уже претерпели узкое место выбор для клеток, которые могли бы расти под двумерные условия, когда была установлена клеточная линия. Необратимые изменения, которые происходят в результате узкого места включают изменения в росте и вторжение свойства, а также потери конкретных субпопуляций. Таким образом, модели, которые лучше резюмировать состояние человека in vivo может лучше предсказать терапевтические стратегии, которые эффективно увеличить общую выживаемость пациентов с метастатической меланомы. Методки ксенотранспланта (PDX) пациента включает в себя прямую имплантацию опухолевых клеток от пациента к получателю мыши. Таким образом, опухолевые клетки постоянно выращиваются под физиологическими нагрузками in vivo и никогда не проходят двухмерное узкое место, которое сохраняет молекулярные и биологические свойства, присутствующие при обнаружении опухоли у пациента. Примечательно, что модели PDX, полученные из органов сайтов метастазов (т.е. мозга) отображают аналогичную метастатическую способность, в то время как модели PDX, полученные из терапии наивных пациентов и пациентов с приобретенной устойчивостью к терапии (т.е. бигибаторной терапии BRAF/MEK) отображаются аналогичная чувствительность к терапии.
Introduction
Доклинические модели имеют решающее значение для всех аспектов трансляционных исследований рака, включая характеристику болезней, открытие действенных уязвимостей, присущих только раку, по сравнению с нормальными клетками, и развитие эффективных методов лечения, которые эксплуатируют эти уязвимости для повышения общей выживаемости пациентов. В области меланомы, десятки тысяч моделей клеточной линии были в значительной степени использованы для скрининга наркотиков, с йgt;4,000 способствовали только нашей группы (WMXXX серии). Эти модели клеточной линии были получены от пациентов с меланомой с различными формами кожной меланомы (т.е. акрала, увеального и поверхностного распространения) и различных генотипов (т.е. BRAFV600-мутант и нейробластома РАН вирусный онкоген однородный НРАС «61R-мутант»), которые охватывают спектр заболеваний, присутствующих в клинике1,2.
Однозначно, наиболее успешная, целевая стратегия терапии в области меланомы возникла из 1) геномной характеристики опухолей пациентов, определяющих мутации BRAF в 50% меланомы3 и от 2) доклинического исследования использование меланомы клеточной линии модели4. Комбинация ингибитора BRAF/MEK была утверждена Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в 2014 году для лечения пациентов, чья меланома гавани активации BRAFV600E / K мутаций и может похвастаться йgt;75% ответ5. Несмотря на эту начальную эффективность, сопротивление быстро возникает почти в каждом случае из-за многогранных внутренних и приобретенных механизмов сопротивления и внутриопухолевой неоднородности. К сожалению, модели клеточных линий не резюмируют репрезентативной биологической неоднородности, когда выращивается в двумерной культуре в пластиковых сосудах, что маскирует их клинически прогностический потенциал, когда исследователи пытаются экспериментально определить терапии, которые могут быть эффективными у пациентов с определенной формой или генотипом меланомы6. Понимание того, как лучше моделировать внутриопухолевую неоднородность пациента позволит следователям лучше разработать терапевтические методы, которые могут убить устойчивых к терапии субпопуляций, которые приводят к неспособности к текущим стандартам лечения.
Первостепенное значение ограниченного прогностического значения моделей клеточной линии — это то, как они изначально устанавливаются. Необратимые изменения происходят в клональном ландшафте опухоли, когда одноклеточная суспензия опухоли пациента выращивается на двухмерных, сосудах культуры пластиковой ткани, включая изменения в пролиферативном и инвазивном потенциале, устранение специфических субпопуляций, и изменение генетической информации7. Xenografts в мышей этих моделей линии клетки меланомы представляют наиболее часто используемые в vivo платформа для preclinical изучений; однако, эта стратегия также страдает от плохой перепросмотра сложной неоднородности опухоли наблюдается клинически. Чтобы преодолеть этот недостаток, наблюдается растущий интерес к включению более сложных доклинических моделей меланомы, включая модель PDX. Модели PDX были использованы для йgt;30 лет, с семенных исследований в больных раком легких, демонстрирующих соответствие между ответом пациентов на цитотоксические агенты и ответ модели PDX, полученных от того же пациента8. В последнее время наблюдается стремление использовать модели PDX в качестве инструмента выбора для доклинических исследований как в промышленности, так и в академических центрах. Модели PDX, из-за их превосходной перепросмотра неоднородности опухоли у пациентов, более клинически уместны для использования вусилиях оптимизации терапии чем xenografts линии клетки 9. В меланоме, Есть огромные препятствия, которые тупой терапевтического управления передовых заболеваний10. Клинически значимые модели PDX были использованы для моделирования клинической резистентности и определения терапевтических стратегий с клинически доступными агентами для лечения устойчивых к терапии опухолей11,12. Кратко, протокол представленный здесь для того чтобы произвести модели PDX требует subcutaneous имплантации свежей ткани от главным образом или метастатических меланом (собранных биопсией или хирургией) в NOD/scid/IL2-рецептор null (NSG) мышей. Различные различия в методологическом подходе используются различными группами; однако, фундаментальное ядро существует13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали генерацию МОДЕЛЕй pdX меланомы с тканью пациента, полученной из первичных и метастатических опухолей, основных биопсий и FNAs. При непосредственном привитом в NSG мышей, опухоли представляют аналогичные морфологические, геномные и биологические свойства для тех, наблюдается у п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Wistar институт животных фонда, микроскопии фонда, гистотехнологии фонда, и научно-исследовательский центр снабжения. Это исследование было частично профинансировано грантами U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), Доктором Мириам и Шелдоном Г. Адельсоном, Фондом медицинских исследований меланомы.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
