En melanom patient afledt xenograft-model
Summary
Patient afledte xenograft (PDX) modeller mere robust rekapitulere melanom molekylære og biologiske egenskaber og er mere forudsigende for terapi respons sammenlignet med traditionelle plast vævskultur-baserede assays. Her beskriver vi vores standard Operations protokol for etablering af nye PDX modeller og karakterisering/eksperimenter af eksisterende PDX modeller.
Abstract
Akkumulerende beviser tyder på, at molekylære og biologiske egenskaber er forskellige i melanom celler dyrket i traditionelle todimensionale vævskultur fartøjer versus in vivo hos humane patienter. Dette skyldes flaskehalsen udvælgelse af klonale populationer af melanom celler, der kan robust vokse in vitro i fravær af fysiologiske betingelser. Desuden afspejler responserne på behandling i todimensionelle vævskulturer generelt ikke på en trofast Vis respons på behandling hos melanompatienter, idet størstedelen af de kliniske forsøg ikke viser effekten af terapeutiske kombinationer, der er påvist at være effektive i In vitro. Selvom xenografering af melanom celler i mus giver den fysiologiske in vivo-kontekst fraværende fra to-dimensionelle vævskultur analyser, har de melanom celler, der anvendes til engraftment, allerede undergået flaskehalsen udvælgelse for celler, der kunne vokse under to-dimensionelle betingelser, når celle linjen blev etableret. De irreversible ændringer, der opstår som følge af flaskehalsen, omfatter ændringer i vækst-og invasions egenskaber samt tab af specifikke delpopulationer. Derfor, modeller, der bedre rekapitulere den menneskelige tilstand in vivo kan bedre forudsige terapeutiske strategier, der effektivt øger den samlede overlevelse af patienter med metastatisk melanom. Den patient afledte xenograft (PDX) teknik involverer direkte implantation af tumorceller fra den menneskelige patient til en mus modtager. På denne måde, tumorceller er konsekvent dyrkes under fysiologiske belastninger in vivo og aldrig gennemgå de to-dimensionelle flaskehalsen, som bevarer de molekylære og biologiske egenskaber til stede, når tumoren var i den menneskelige patient. Bemærkelsesværdige, PDX-modeller afledt af organ sider med metastaser (dvs. hjernen) udviser lignende metastatisk kapacitet, mens PDX-modeller afledt af behandlingsnaive patienter og patienter med erhvervet resistens over for behandling (dvs. BRAF/MEK-inhibitor terapi) viser lignende følsomhed over for terapi.
Introduction
Prækliniske modeller er afgørende for alle aspekter af translationel kræftforskning, herunder sygdomskarakterisering, opdagelse af handlingsrettede sårbarheder unikke for kræft versus normale celler, og udviklingen af virkningsfulde terapier, der udnytter disse sårbarheder for at øge patienternes samlede overlevelse. I melanom feltet, titusinder af cellelinje modeller er blevet stærkt udnyttet til Drug screening, med > 4000 bidraget af vores gruppe alene (wmxxx Series). Disse cellelinje modeller blev afledt af melanompatienter med forskellige former for kutan melanom (dvs. Acral, ukalvekød og overfladisk spredning) og forskellige genotyper (dvs. BRAFV600-mutant og neuroblastom RAS viral onkogen ligner [ NTM Q61R-mutant]), som spænder over det spektrum af sygdomme, der findes i klinikken1,2.
Utvetydigt, den mest vellykkede, målrettede terapi strategi i melanom feltet er dukket op fra 1) den genomiske karakterisering af patienternes tumorer identificere BRAF mutationer i ~ 50% af melanomer3 og fra 2) prækliniske undersøgelse udnyttelse af melanom cellelinje modeller4. Kombinationen af BRAF/MEK-hæmmere var Food and Drug Administration (FDA)-godkendt i 2014 til behandling af patienter, hvis melanomer havn aktivering af BRAFV600E/K -mutationer og kan prale af en > 75% responsrate5. På trods af denne indledende virkning opstår resistens hurtigt i næsten alle tilfælde på grund af mangfoldige iboende og erhvervede resistensmekanismer og intratumoral heterogenitet. Desværre, cellelinje modeller ikke rekapitulere repræsentative biologisk heterogenitet, når de dyrkes i todimensionale kultur i plastbeholdere, som maskerer deres klinisk forudsigelige potentiale, når forskerne forsøger at eksperimentelt bestemme behandlingsformer, der kan være effektive hos patienter med en specifik form eller genotype af melanom6. Forståelse af hvordan man bedst model patient intratumoral heterogenitet vil gøre det muligt for undersøgere bedre at udvikle terapeutiske modaliteter, der kan dræbe terapi-resistente subpopulationer, der drev manglende nuværende standard-of-Care terapier.
Altafgørende for den begrænsede prædiktive værdi af cellelinje modeller er, hvordan de oprindeligt blev etableret. Irreversible ændringer forekommer i tumor klonale landskab, når en enkelt cellesuspension af en patienternes tumor dyrkes på to-dimensionelle, plast væv kultur fartøjer, herunder ændringer i proliferativ og invasiv potentiale, eliminering af specifikke subpopulationer og ændring af genetisk information7. Xenografts til mus af disse melanom cellelinje modeller repræsenterer den hyppigst anvendte in vivo platform for prækliniske studier; Men, denne strategi lider også af den dårlige rekapitulation af komplekse tumor heterogenitet observeret klinisk. For at overvinde denne mangel, har der været en stigende interesse i at indarbejde mere sofistikerede prækliniske modeller af melanom, herunder PDX model. PDX modeller er blevet udnyttet i > 30 år, med skelsættende undersøgelser af lungekræft patienter viser overensstemmelse mellem patienternes respons på cytotoksiske midler og respons af PDX-modellen afledt af den samme patient8. For nylig har der været et drev til at udnytte PDX-modeller som det foretrukne værktøj til prækliniske undersøgelser både i branchen og i akademiske centre. PDX modeller, på grund af deres overlegne rekapitulation af tumor heterogenitet i humane patienter, er mere klinisk relevante for brug i terapi optimering indsats end cellelinje xenografter9. I melanom, der er enorme forhindringer, der sløv den terapeutiske forvaltning af avanceret sygdom10. Klinisk relevante PDX-modeller er blevet brugt til at modellere klinisk resistens og identificere terapeutiske strategier med klinisk tilgængelige midler til behandling af terapi resistente tumorer11,12. Kort, den protokol, der præsenteres her for at generere PDX modeller kræver subkutan implantation af fersk væv fra primære eller metastatiske melanomer (indsamlet ved biopsi eller kirurgi) i NOD/scid/ilds-receptor null (NSG) mus. Forskellige grupper anvender forskellige variationer i metodologisk tilgang; der findes imidlertid en grundlæggende kerne13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har heri beskrevet genererer PDX modeller af melanom med patient væv afledt af primære og metastatiske tumorer, kerne biopsier, og FNAs. Når direkte indpodet i NSG mus, tumorer præsentere lignende morfologiske, genomiske, og biologiske egenskaber til dem, der observeres i patienten. I tilfælde, hvor kun en lille mængde væv er til rådighed for undersøgere, som ofte opstår med FNAs, den PDX teknik giver mulighed for udvidelse af tumorvæv for DNA, RNA, og protein karakterisering, samt for terapi forsøg til at…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Wistar Institute Animal facilitet, mikroskopi facilitet, Histotechnology Facility, og forskning Supply Center. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af tilskud fra U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation og Melanoma Research Foundation.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
