여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.
CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9)로 표현되는 유전자 편집 뉴클레아제는 생물 의학 연구에서 주류 도구가되고 있습니다. 형질전환에 의한 CRISPR/Cas9 원소를 표적 세포로 성공적으로 전달하는 것은 효율적인 유전자 편집을 위한 전제 조건이다. 이 프로토콜은 튜브 전기 천공 (TE) 기계 매개 된 CRISPR /Cas9 리보뉴클레오 프로테인 (RNP)과 단일 가닥 올리고덱시뉴클레오티드 (ssODN) 기증자 템플릿이 다양한 유형의 포유류 세포에 전달됨을 입증하고 강력한 것으로 이어집니다. 정확한 유전자 편집 이벤트. 먼저, TE는 토끼 섬유아세포에서 CRISPR/Cas9 RNP 및 ssODN을 전달하여 인터류키핀 2 수용체 소단위 감마(IL2RG) 유전자 및 세피압테린 환원효소(SPR) 유전자에서 질병을 유발하는 돌연변이를 유도하기 위해 적용하였다. 3.57%-20%의 정확한 돌연변이율은 세균 TA 클로닝 시퀀싱에 의해 결정된 바와 같이 달성되었다. 동일한 전략은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 미오신 결합 단백질 C, 심장 (Mybpc3), 및 헤모글로빈 소단위 베타 (HBB)를 포함한 여러 임상적으로 관련된 유전자에 인간 iPSCs에서 사용되었다. 일관되게, 고정밀 돌연변이율(11.65%-37.92%)을 달성했습니다. 깊은 시퀀싱 (DeepSeq)에 의해 결정됩니다. 본 연구는 CRISPR/Cas9 RNP의 튜브 전기화가 포유류 세포에서 유전자 편집을 위한 효율적인 형질감염 프로토콜을 나타낸다는 것을 입증한다.
CRISPR/Cas9는 유전자 편집을 위해 가장 일반적으로 사용되는 프로그래밍 가능한 뉴클레아제입니다. 그것은 게놈에 있는 단 하나 가이드 RNA (sgRNA)-측량 둘 다 표적 서열 및 인접한 protospacer 인접 한 모티프 (PAM) 서열을 통해 작동합니다. Cas9 뉴클레아제는 PAM 서열1의상류에 위치한 이중 가닥 DNA 브레이크(DSB)를 생성한다. DSB는 오류가 발생하기 쉬운 비상동성 엔드 접합(NHEJ) 또는 상동성 지향 수리(HDR) 경로를 통해 수리됩니다. HDR 통로를 통해 정밀한 유전자 편집을 달성하기 위해, 기증자 템플릿은 종종 플라스미드 DNA (pDNA) 또는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (ssODN)의 형식으로 제공됩니다.
CRISPR/Cas9 및 sgRNA는 세 가지 형식으로 세포에 전달될 수 있다: Cas9 단백질및 gRNA2,3; Cas9 mRNA 및sgRNA 4,5; 또는 플라스미드 DNA(pDNA)는 필요한 프로모터, 구동sgRNA 및Cas9 코딩 영역 6,7,8을함유한다. 많은 단은 CRISPR/Cas9가 RNP로 전달될 때, 유전자 편집 효율성이 수시로 핵산9에비교된 RNP의 훨씬 더 작은 크기에 기인하는 pDNA 또는 mRNA 형식에서 달성된 것을 능가한다는 것을 설명했습니다. 더욱이, 신규한 튜브 전기천공(TE) 기계가 여러 세포 유형 9에서 유전자편집 응용 분야에서 특히 효과적이라는 것을 이전에 보여주었다.
본 서에 제시된 여러 임상적으로 관련 있는 동위에서 상이한 종의 포유류 세포에 CRISPR/Cas9 RNP의 전달을 위한 TE를 활용하는 단계별 프로토콜이다. 이 새로운 TE 형질 감염 기술 및 높은 HDR 속도 현상은 생물 의학 연구에서 광범위한 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다.
튜브 전기 천공 방법은 CRISPR /Cas9 RNP 및 ssODN을 토끼및 인간 세포에 전달하여 강력한 정밀 유전자 편집 (PGE)을 이끌어 내는 데 효과적이었다. TE와 다른 기존의 전기 화기 장치의 주요 차이점은 두 개의 전극이 튜브의 상단과 하단에 있고 샘플이 전기 화시에 완전히로딩된 후 전체로 밀봉되는 튜브의 사용입니다(그림 1). 대조적으로, 기존의 큐벳에서, 전극은 측면에 있고 샘플은 전기 천공 중에 완전히 밀봉되지 않습니다. 이 새로운 디자인은 기포 생성을 줄이고 기포 크기를 압축하여 결과적으로 전기 전압의 균일한 분포를 개선하며 결과적으로세포 사멸 및 높은 형질 전환 효율 9을 유도합니다. 본 작품에서, 높은 PGE 비율 (15%-37%) 인간 iPSCs에서 EGFR, Mybpc3 및 HBB 유전자를 표적으로 하는 것을 달성했습니다. 이러한 결과는 인간 줄기 세포에서 높은 PGE 비율이 달성된이전 보고서와 일치합니다 9.
질병을 일으키는 돌연변이는 토끼 세포에서 IL2RG 및 SPR 유전자를 표적으로 하였다. 최근, IL2RG-녹아웃 토끼는 인간 X-연결된 심한 결합 면역 결핍(SCID-X1)16,17에대한 모델로서 생산되고 있다. 본 작품은 환자 IL2RG 돌연변이(예를 들어, C231Y 및 Q235X)가 토끼 세포에서 효율적으로 생성될 수 있음을 보여주며, 환자 돌연변이를 운반하는 SCID-X1 토끼 모델을 생성할 수 있는 가능성을 입증한다. 또한 SPR R150G 돌연변이가 토끼 세포에서 효율적으로 생성될 수 있음을 입증하였다. 이 돌연변이는 아이들에 있는 모터 그리고 인식 적자를 일으키는 원인이 됩니다12. 이러한 IL2RG 및 SPR 돌연변이 토끼 모델은 일단 생성되면, 번역 연구를 위한 귀중한 전임상 모델로 작용할 수 있다. 그(것)들은 또한 이 단원 질병을 위한 유전자 편집 기지를 둔 치료제를 설치하기 위하여 이용될 수 있습니다.
CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집 응용 프로그램에 대한 한 가지 관심사는 오프 타겟 편집 이벤트입니다. 인델 비율은 앞서 설명한방법9를 사용하여 본 연구에서 사용되는 sgRNAs에 대한 예측 상부 오프 타겟 사이트에서 분석되었다(표S1). 표 S2에나열된 프라이머를 사용하여 총 7개의 잠재적 상부 오프 타겟 로시를 sg-rb-IL2RG-01, sg-rb-SPR5, sg-hEGFR에 대한 7개, sg-hMybpc3에 대해 5개, sg-hHBB에 대해 7개, 7개의 잠재적 상부 오프-타겟 로시를 분석했다. 이러한 sgRNAs를 사용하여 CRISPR/Cas9 매개유전자 편집에 대한 최소한의 오프 타겟 위험을 나타내는 T7E1 검문(그림 S1)에 의해 오프 타겟 인델이 밝혀지지 않았습니다. 또한 튜브 전기 화 방법 자체가 오프 타겟 편집을 유발하거나 증가시키지 않음을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 바람직하지 않은 오프 타겟 편집을 줄이거나 제거하기 위한 노력이 전념해야 합니다. 전체 게놈 시퀀싱은 임상 적용에서 사용되는 세포에 대한 이러한 이벤트를 배제하는 데 필요할 수 있다.
기술적 수준에서, 다음은 CRISPR/Cas9 RNP 관 전기천공에 의하여 능률적인 정확한 게놈 편집을 달성하기 위한 중요한 요소로 간주됩니다. 먼저, 낮은 오프-타겟 전위를 가진 효율적인 sgRNA를 선택하는 것이 좋습니다. PEG 어플리케이션에 사용하기 전에 선택된 sgRNA의 인델 효율을 검증하는 것이 중요합니다. 유효성 검사 단계에서 양호한 sgRNA가 실패할 것으로 예측된 소프트웨어가 드문 일은 아닙니다.
둘째, 높은 PGE를 달성하기 위해, 가능하면 ssODN 공여물로 PAM 돌연변이를 유도하는 것이 좋습니다. 그 근거는 이렇게 함으로써, CRISPR/Cas9 기증자 템플릿 통합 후에 재절단이 방지된다는 것입니다. 특정 경우에, PGE 자체는 PAM 돌연변이를 소개합니다. 다른 경우에, PAM 서열에 침묵 돌연변이를 도입할 수 있다. PAM 돌연변이가 불가능한 경우에, sgRNA 서열에 대응하는 공여자에 몇몇 침묵하는 돌연변이를 포함하는 것을 시도하는 것이 좋습니다.
셋째, 특히 TE와 관련이 있는 것은, 세포 및 RNP 혼합물을 전기 천공 관으로 옮길 때 기포의 형성을 피하는 것이 중요하다. TE 튜브의 설계는 이미 기포 형성을 최소화하지만, 신중한 취급은 더욱 감소하고 심지어 기포 형성을 피할 수 있습니다. CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질을 위한 튜브 전기포공의 적용에서 발생할 수 있는 빈번한 문제에 대한 트러블 슈팅 가이드는 표2에 제공된다.
결론적으로, 튜브 전기 천공은 높은 PGE 속도를 달성하기 위해 포유류 세포에 CRISPR / Cas9 RNP 및 ssODN의 전달을위한 효과적인 수단임을 입증한다. 이 새로운 TE 형질 감염 기술 및 그것의 강력한 정확한 유전자 편집 속도는 유전자 편집 응용 프로그램의 발달을 촉진할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (JX에 R21OD023194). 이 작품은 미시간 대학 의료 센터에서 번역 과학 및 치료 (CAMTraST)에 대한 고급 모델 센터에서 지원하는 핵심 서비스를 활용.
Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |