Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller

Summary

Kultivert primære eller etablerte cellelinjer er ofte brukt til å ta grunnleggende biologiske og mekanistisk spørsmål som en første tilnærming før du bruker dyremodeller. Denne protokollen beskriver hvordan man skal tilberede hele celle ekstrakter og subcellulære fraksjoner for studier av sink (Zn) og andre sporstoffer med Atomic absorbansen spektroskopi.

Abstract

Overgangs metaller er essensielle mikronæringsstoffer for organismer, men kan være giftig for celler ved høye konsentrasjoner ved å konkurrere med fysiologiske metaller i proteiner og generere Redox stress. Patologiske tilstander som fører til tømming av metall eller akkumulering er årsakssammenheng mellom ulike menneskelige sykdommer. Noen eksempler er anemi, acrodermatitis enteropathica, og Wilson ‘ s og Menkes ‘ sykdommer. Det er derfor viktig å være i stand til å måle nivåene og transport av overgangs metaller i biologiske prøver med høy følsomhet og nøyaktighet for å gjøre det lettere å undersøke hvordan disse elementene bidrar til normale fysiologiske funksjoner og Toksisitet. Sink (Zn), for eksempel, er en kofaktor i mange pattedyr proteiner, deltar i signalering hendelser, og er en sekundær Messenger i cellene. I overkant, Zn er giftig og kan hemme absorpsjon av andre metaller, mens i underskudd, kan det føre til en rekke potensielt dødelige forhold.

Grafitt ovn Atomic absorpsjon spektroskopi (GF-AAS) gir en svært følsom og effektiv metode for å bestemme Zn og andre overgangen metall konsentrasjoner i ulike biologiske prøver. Elektrotermiske forstøvning via GF-AAS kvantifiserer metaller ved Forstøvende små mengder av prøver for påfølgende selektiv absorpsjon analyse ved hjelp av bølgelengde av eksitasjon av elementet av interesse. Innenfor rammene av linearitet av Beer-Lambert Law, er absorbansen av lys av metallet direkte proporsjonal med konsentrasjonen av analytt. Sammenlignet med andre metoder for å bestemme Zn innhold, oppdager GF-AAS både frie og complexed Zn i proteiner og muligens i små intracellulære molekyler med høy følsomhet i små prøve volumer. Dessuten er GF-AAS også lettere tilgjengelig enn Induktivt kombinerte plasma masse massespektrometri (ICP-MS) eller Synchrotron røntgen fluorescens. I denne metoden beskrives den systematiske prøve forberedelsen av ulike kulturperler for analyser i en GF-AAS. Variasjoner i dette sporet element ble sammenlignet i både hele cellen lysater og subcellulære fraksjoner av voksende og differensiert celler som bevis på prinsippet.

Introduction

Overgang og tungmetaller, slik som Zn, Cu, MN, og Fe, finnes naturlig i miljøet i både næringsstoffer i mat og forurensning. Alle levende organismer krever forskjellige mengder av disse mikronæringsstoffer; eksponering for høye nivåer er imidlertid skadelige for organismer. Metall oppkjøp er hovedsakelig gjennom dietten, men metaller kan også inhalert eller absorberes gjennom huden^1,2,3,4,5. Det er viktig å merke seg at tilstedeværelsen av metaller i atmosfæriske partikler er økende og har vært i stor grad forbundet med helserisiko. På grunn av menneskeskapte aktiviteter har det blitt påvist økte nivåer av tungmetaller som AG, som, CD, CR, HG, ni, fe og Pb i atmosfæriske partikler, regnvann og jord^6,7. Disse metaller har potensial til å konkurrere med essensielle fysiologiske sporelementer, spesielt Zn og Fe, og de induserer toksiske effekter av inaktivere grunnleggende enzymer for biologiske prosesser.

Trace element Zn er Redox nøytral og oppfører seg som en Lewis Acid i biologiske reaksjoner, noe som gjør det til en grunnleggende kofaktor nødvendig for protein folding og katalysator i over 10% av pattedyr proteiner^{8,9, 10}andre; Følgelig er det viktig for ulike fysiologiske funksjoner^8,11. Men som mange sporstoffer, det er en delikat balanse mellom disse metaller tilrettelegge normal fysiologisk funksjon og forårsaker toksisitet. I pattedyr, Zn mangler føre til anemi, vekst retardasjon, hypogonadisme, hud unormalt, diaré, alopecia, smaksforstyrrelser, kronisk betennelse, og nedsatt immun-og nevrologiske funksjoner^{11,12, 13,14,15},^16,17,18. I overkant er Zn cytotoksisk og hemmer absorpsjon av andre essensielle metaller som kobber^19,20,21.

I tillegg har noen metaller som Cu og Fe potensial til å delta i skadelige reaksjoner. Produksjon av reaktive oksygen arter (ros) via Fenton kjemi kan forstyrre monteringen av jern svovel klynge proteiner og endre lipid metabolisme^22,23,24. For å hindre denne skaden, celler utnytte metall-binding chaperones og transportører for å hindre toksiske effekter. Utvilsomt, må metall homeostase være strengt kontrollert for å sikre at bestemte celletyper opprettholde riktig nivå av metaller. Av denne grunn er det et betydelig behov for å fremme teknikker for nøyaktig måling av spor metaller i biologiske prøver. I utvikling og modne organismer finnes det en differensial biologisk behov for sporstoffer på cellenivå, på ulike utviklingsmessige stadier, og i normale og patologiske tilstander. Derfor nøyaktig bestemmelse av vev og systemiske metall nivåer er nødvendig for å forstå organismal metall homeostase.

Grafitt Furnace Atomic absorpsjon massespektrometri (GF-AAS) er en svært følsom teknikk som brukes for små prøve volumer, noe som gjør det ideelt å måle overgangen og tungmetaller tilstede i biologiske og miljømessige prøver^{25,26 , 27} andre priser ^{, 28}. videre, på grunn av høy følsomhet av teknikken, har det vist seg å være hensiktsmessig for å studere de fine transport egenskapene til na⁺/K⁺-ATPase og mage H⁺/K⁺-ATPase ved hjelp av Xenopus oocytter som modell system²⁹. I GF-AAS, de atomized elementene i et utvalg absorberer en bølgelengde av stråling som slippes ut av en lyskilde som inneholder metall av interesse, med absorbert stråling proporsjonal med konsentrasjonen av elementet. Elemental elektronisk eksitasjon finner sted ved absorpsjon av ultrafiolett eller synlig stråling i en kvantisert prosess som er unik for hvert grunnstoff. I en enkelt elektron prosess innebærer opptaket av et foton et elektron som beveger seg fra et lavere energi nivå til et høyere nivå i Atom-og GF-AAS bestemmer mengden av fotoner som absorberes av prøven, som er proporsjonal med antall strålings absorberende elementer atomized i grafitt røret.

Selektivitet av denne teknikken er avhengig av den elektroniske strukturen av atomer, der hvert element har en bestemt absorpsjon/utslipp Spectral linje. I tilfelle av Zn, den absorbansen bølgelengde er 213,9 NM og kan være nøyaktig skilles fra andre metaller. Overall, GF-AAS kan brukes til å kvantifisere Zn med tilstrekkelige grenser for deteksjon (LOD) og høy følsomhet og selektivitet²⁵. Endringene i absorbert bølgelengde er integrert og presentert som topper energi absorpsjon på bestemte og isolerte bølgelengder. Konsentrasjonen av Zn i en gitt prøve beregnes vanligvis fra en standard kurve av kjente konsentrasjoner i henhold til Beer-Lambert-loven, hvor absorbansen er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av Zn i prøven. Men å anvende Beer-Lambert-ligningen på GF-AAS-analyser viser også noen komplikasjoner. Variasjoner i forstøvning og/eller ikke-homogene konsentrasjoner av prøvene kan for eksempel påvirke metall målingene.

Metall forstøvning som kreves for GF AAS sporings element analyse består av tre grunnleggende trinn. Det første trinnet er desolvation, hvor det flytende løsemiddel er fordampet; forlater tørre forbindelser etter at ovnen når en temperatur på rundt 100 ° c. Deretter blir forbindelsene fordampet ved å varme dem fra 800 til 1 400 ° c (avhengig av elementet som skal analyseres) og bli en gass. Til slutt er forbindelsene i gass-staten atomized med temperaturer som spenner fra 1 500 til 2 500 ° c. Som diskutert ovenfor, vil økende konsentrasjoner av et metall av interesse gjengi proporsjonal økning på absorpsjon oppdages av GF-AAS, men ovnen reduserer det dynamiske spekteret av analyser, som er den arbeider spekter av konsentrasjoner som kan bestemmes av instrumentet. Således krever teknikken lave konsentrasjoner og en forsiktig bestemmelse av det dynamiske spekteret av metoden ved å bestemme LOD og grensen for linearitet (LOL) av Beer-Lambert lov. Den LOD er det minste antallet som kreves for en substans som skal oppdages, definert som tre ganger standardavviket for Zn i matrisen. Den LOL er den maksimale konsentrasjon som kan oppdages ved hjelp av Beer-Lambert lov.

I dette arbeidet beskriver vi en standard metode for å analysere nivåene av Zn i hele celle ekstrakter, cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner, og i voksende og differensiere kulturperler celler (figur 1). Vi tilpasset den raske isolering av kjerner protokollen til ulike cellulære systemer for å hindre metall tap under prøveforberedelse. Den cellulære modeller som brukes var primære myoblasts avledet fra musen satellitt celler, murine neuroblastom celler (N2A eller Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytter, en menneskelig ikke-tumorigene bryst epitel cellelinje (MCF10A), og epitel Madin-Darby canine nyre ( MDCK)-celler. Disse cellene ble etablert fra ulike linjene og er gode modeller for å undersøke avstamning spesifikke variasjoner av metall nivåer in vitro.

Primær myoblasts avledet fra mus satellitt celler utgjør en godt egnet in vitro modell for å undersøke skjelettlidelser muskel differensiering. Spredning av disse cellene er rask når kultivert under høye serum forhold. Differensiering i muskel avstamning blir deretter indusert av lavt serum forhold³⁰. Den murine neuroblastom (N2A) etablerte cellelinje ble avledet fra musen neural Crest. Disse cellene presentere neuronal og Amoeboid stilk cellen morfologi. Ved differensiering stimulans, de N2A cellene presentere flere egenskaper av neurons, som neurofilamenter. N2A celler brukes til å etterforske Alzheimers sykdom, neurite utvekst, og nevrotoksisitet^31,32,33. Den 3T3-L1 murine pre-adipocytter etablerte cellelinjen er vanligvis brukes til å undersøke metabolske og fysiologiske endringer forbundet med adipogenesis. Disse cellene presentere en Fibroblast-lignende morfologi, men når stimulert for differensiering, presenterer de enzymatisk aktivering forbundet med lipid syntese og triglyserider akkumulering. Dette kan observeres som morfologiske endringer for å produsere cytoplasmatiske lipid dråper^34,35. MCF10A er en ikke-tumor bryst epitel cellelinje avledet fra en premenopausale kvinne med bryst fibrocystic sykdom³⁶. Det har vært mye brukt for biokjemiske, molekylær, og cellulære studier knyttet til brystkreft som spredning, celle migrasjon, og invasjon. Den Madin-Darby canine nyre (MDCK) epitel cellelinjen har blitt mye brukt til å undersøke egenskaper og molekylære hendelser knyttet til etablering av epitel fenotype. Ved å nå samløpet, disse cellene blir polarisert og etablere celle-celle adhesjon, egenskaper av pattedyr epitel vev³⁷.

For å teste AAS evne til å måle nivåene av Zn i pattedyrceller, analyserte vi hele og subcellulære fraksjoner (stoffer og nucleus) av disse fem cellelinjene. AAS-målinger viste ulike konsentrasjoner av Zn i disse celle typene. Konsentrasjonen var lavere i voksende og differensiering primære myoblasts (4 til 7 nmol/mg protein) og høyere i de fire etablerte cellelinjer (alt 20 til 40 nmol/mg protein). En liten ikke-signifikant økning i Zn nivåer ble påvist i å skille primære myoblasts og neuroblastom celler i forhold til voksende celler. Den motsatte effekten ble påvist i differensiert adipocytter. Men voksende 3T3-L1-celler viste høyere konsentrasjoner av metallet sammenlignet med differensiert celler. Viktigere, i disse tre cellelinjer, subcellulære fraksjonering viste at Zn er differensielt distribueres i stoffer og kjernen i henhold til metabolsk tilstand av disse cellene. For eksempel, i voksende myoblasts, N2A celler, og 3T3-L1 pre-adipocytter, et flertall av metallet er lokalisert til kjernen. Ved induksjon av differensiering ved hjelp av spesifikke celle behandlinger, Zn lokalisert til stoffer i disse tre celletyper. Interessant, viste både epitel cellelinjer høyere nivåer av Zn under spredning sammenlignet med når samløpet, der en karakteristisk stram monolag ble dannet. I voksende epitelceller, bryst cellelinjen MCF10A hadde en lik Zn fordeling mellom stoffer og kjernen, mens i nyre-avledet cellelinje, det meste av metallet var plassert i kjernen. I disse to celle typene, da cellene nådde samløpet, var Zn overveiende lokalisert til stoffer. Disse resultatene viser at GF-AAS er en svært følsom og nøyaktig teknikk for å utføre elementær analyse i lav kapasitets prøver. GF-AAS kombinert med subcellulære fraksjonering og kan tilpasses for å undersøke nivåene av sporstoffer metall elementer i ulike cellelinjer og vev.

Protocol

1. pattedyr cellekultur Generelle hensyn Følg aseptisk teknikk for pattedyr cellekultur som tidligere har gjennomgått38. Oppretthold alle cellelinjer i en fuktet 5% CO2 inkubator ved 37 ° c. Cellekultur forhold varierer for hver celle type. Det er viktig å opprettholde passende kultur forhold for hver cellelinje som brukes, som variasjoner av disse prosedyrene vil føre til avvikende fenotyper og svikt i celle kulturen. Sikr…

Representative Results

Vi testet GF-AAS evne til å påvise minutt nivåer av Zn i pattedyrceller (figur 1). Derfor, vi kultivert primære myoblasts avledet fra musen satellitt celler, og de etablerte cellelinjer N2A (neuroblastom avledet), 3T3 L1 (adipocytter), MCF10A (bryst epitel), og MDCK celler (hund nyre epitel). Først isolerte vi hele celle, cytosolic, og kjernefysiske fraksjoner av alle disse celletyper og evaluert renheten av fraksjoner av Western Blot (<strong class="xfi…

Discussion

Atomic absorbansen spektroskopi er en svært følsom metode for Zn kvantifisering i små volum/masse biologiske prøver. Den beskrevne optimaliseringen av Zn måling gjør anvendelsen av denne metoden enkel og garanterer ideelle analytiske forhold. Her, ved hjelp av GF-AAS, bestemte vi konsentrasjonen av Zn i hele celler, og i cytosolic og kjernefysiske fraksjoner, fra ulike cellelinjer. Resultatene viser at denne teknikken gjengir sammenlignes med de som oppnås ved fluorescerende sonder og ICP-MS. For eksempel, flere f…

Materials

3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma Aldrich	I5879
Acetic Acid	Sigma Aldrich	1005706
Anti Brg1-antibody (G7)	Santa Cruz biotechnologies	sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R)	Thermo Scientific	MA5-16308
Bradford	Biorad	5000205
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)	ThermoFischer-Gibco	11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)	ThermoFischer-Gibco	11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFischer-Gibco	14190144
Epidemal Growth Factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFischer-Gibco	16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)	ThermoFischer-Gibco	PHG0024
Horse serum	ThermoFischer-Gibco	16050122
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2)	Sigma Aldrich	95321
Insulin	Sigma Aldrich	91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A	ThermoFischer	51300044
Nitric Acid (HNO3)	Sigma Aldrich	438073
Nonidet P-40 (NP-40)	Thermo Scientific	85125
OptiMEM (Reduced Serum Media)	ThermoFischer-Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer-Gibco	15140148
PureCol (Collagen)	Advanced BioMatrix	5005
Retionic Acid	Sigma Aldrich	PHR1187
Troglitazone	Sigma Aldrich	648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFischer-Gibco	25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3	Perkin Elmer	N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1	American Type Culture Collection	CL-173
MCDK	American Type Culture Collection	CCL-34
MCF10A	American Type Culture Collection	CRL-10317
N2A	American Type Culture Collection	CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer	PerkinElmer	Aanalyst 800
Bioruptor	Diagnode	UCD-200