यहां, हम एक संयोजी दृष्टिकोण वर्तमान उच्च संकल्प microscopy, कंप्यूटेशनल उपकरण का उपयोग कर, और सी एलिगेंस भ्रूण में एकल कोशिका लेबलिंग neurodevelopment के दौरान एकल कोशिका गतिशीलता को समझने के लिए ।
कैनोहैब्डिटिस एलिगेंस (ग. एलिगेंस) एकमात्र जीव है जिसमें एक पूरे तंत्रिका तंत्र के सेलुलर मूल को समझने की चुनौती, एकल कोशिका संकल्प के साथ, vivo में मनाया जा सकता है के रूप में बाहर खड़ा है । यहाँ, हम C. एलिगेंस भ्रूणों में न्यूरोडेवलपमेंट की जाँच के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हमारे प्रोटोकॉल इमेजिंग, lineaging और भ्रूण के विकास में एकल कोशिकाओं के neuroसंरचनात्मक अनुरेखण को जोड़ती है । हम प्राप्त करने के दीर्घकालिक, चार आयामी इमेजिंग C. एलिगेंस भ्रूण के साथ लगभग समदैशिक स्थानिक संकल्प के उपयोग के माध्यम से दोहरे-दृश्य औंधा चयनात्मक विमान रोशनी microscopy (dispim). सूत्रकृमि भ्रूण में नाभिक और न्यूरोनल संरचनाएं imaged और isotropically सभी तीन आयामों में ~ ३३० एनएम के संकल्प के साथ छवियों को उपज के लिए किया जाता है । इन मिनट-दर-मिनट उच्च संकल्प 4D डेटा सेट तो एक सेल और विस्तार के subcellular स्तर पर जीन अभिव्यक्ति और रूपात्मक गतिशीलता के साथ निश्चित सेल-वंशावली पहचान सहसंबंध के लिए विश्लेषण कर रहे हैं । हमारे प्रोटोकॉल वर्णित चरणों में से प्रत्येक के मॉड्यूलर कार्यांवयन सक्षम और embryogenesis, जीन अभिव्यक्ति, या neurodevelopment पर अध्ययन को बढ़ाने के लिए संरचित है ।
C. एलिगेंस केवल जीव है जिसमें भ्रूण में हर कोशिका neurodevelopment में मनाया जा सकता है के रूप में बाहर खड़ा है । पूरे सेल-वंशावली ज्ञात और1अपरिवर्तनीय के साथ, और नए उपकरण है कि भ्रूण में एक कोशिकाओं के लेबलिंग और सतत इमेजिंग की अनुमति के विकास के साथ, जीव अब सूत्रकृमि के विकास में विभिंन चरणों की जांच शुरू कर सकते है तंत्रिका सभी कोणों से प्रणाली-सेल जंम; प्रवास और विभेदन; न्यूरोराइट गठन, लक्षित बहिर्वृद्धि और पूकुलेशन; synapse गठन; और कार्यात्मक सर्किट की ट्यूनिंग । Stably व्यक्त संवाददाताओं और प्रतिदीप्ति microscopy के संयोजन से सी एलिगेंस भ्रूण में न्यूरोनल वृद्धि गतिशीलता पर कब्जा, वैज्ञानिक समुदाय के लिए मूल्यवान है.
सी एलिगेंस में विकासात्मक अध्ययन अक्सर अपरिवर्ती कोशिका-वंशावली और सेल के भाग्य का लाभ उठाने इस प्रजाति के नक्शे को बरकरार जीव1के भीतर एकल कोशिका स्तर पर प्रासंगिक समझ बढ़ाने के लिए । ऑटो-lineaging विश्लेषण-starrynite का उपयोग2,3,4 और एसीट्री5,6,7,8 सॉफ्टवेयर-उच्च कंट्रास्ट से लाभ, उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट नाभिक की छवियाँ. बेहतर काम करने के लिए, StarryNite/AceTree भी विकास के दौरान imaged भ्रूण की उंमीद के मुताबिक विवश उंमुखीकरण पर निर्भर करता है । Confocal माइक्रोस्कोपी, दो coverslips के बीच संकुचित सी एलिगेंस भ्रूण में किया, एक दशक से अधिक के लिए मानक ऑटो lineaging माइक्रोस्कोपी विधि गया है, क्योंकि यह दोनों उच्च विपरीत प्रदान करता है/ भ्रूण का अभिविन्यास7,8. हम पहले निर्माण और एक उपंयास प्रकाश के उपयोग का वर्णन-चादर आधारित दोहरे देखें उल्टे चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोप (dispim) जी नमूना इमेजिंग के लिए जैसे सी एलिगेंस भ्रूणोद्भव9,10 , 11 , 12 , 13. प्रकाश शीट microscopy, सामांय में, कम phototoxicity, उच्च गति, और जीने 3d नमूनों14,15के दीर्घकालिक इमेजिंग प्रदान करता है । Dispim विधि, विशेष रूप से, लगभग ३३० एनएम9के लगभग समदैशिक स्थानिक संकल्प के साथ चार आयामी (4d) छवियों का उत्पादन ।
संनाभि माइक्रोस्कोपी के साथ तुलना में, dispim उच्च संकेत करने वाली शोर और गति, अधिक समदैशिक स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, और वीवो इमेजिंग16 में लंबी अवधि के लिए अधिक उपयुक्त है । इसलिए हम StarryNite में इनपुट के लिए diSPIM डेटा को अनुकूलित करने के लिए काम/ एक बड़ी बाधा यह है कि diSPIM नमूनों StarryNite के लिए उंमीद झुकाव को अपनाने के लिए eggshell संपीड़न द्वारा आसानी से विवश नहीं किया जा सकता/ मात्रा में कोशिका की स्थिति का यादृच्छिक उंमुखीकरण विश्लेषण किया जा रहा है degrades ऑटो की सटीकता-lineaging ।
हम इसलिए, एक दर्शक-निर्देशित उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस जो उपयोगकर्ताओं को पूर्व के दौरान भ्रूण के सटीक 3 डी अभिविन्यास का चयन करने के लिए diSPIM छवियों के प्रसंस्करण, छवि डेटा है कि दोनों गुणवत्ता अनुकूलित और संदर्भ-StarryNite में इनपुट के लिए पता है उपज की अनुमति देता है । /एसीरी। Imaged भ्रूण के उपयोगकर्ता चयन पर, CytoSHOW एक स्वचालित डेटा प्रसंस्करण पाइपलाइन orchestrates । फसली और पृष्ठभूमि-घटाया भ्रूण छवियों प्रत्येक स्थिति, timepoint और देखने के लिए TIFF स्टैक फ़ाइलों के भीतर बच रहे हैं । साइटोशो फिर iteratively कार्यक्रम spimfusion को सह रजिस्टर और संयुक्त रूप से दो पूर्व संसाधित विचार deconvolve, रिचर्डसन-लुसी17,18 एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए समदैशिक उच्च संकल्प आयतनी छवियां उपज कॉल । मानक के एक dispim-विशिष्ट सेट starrynite के लिए अनुकूलित किया गया है छवि के दौरान अपने व्यवहार-विभाजन और नाभिक-isotropically संगलित त छवियों में ट्रैकिंग । Fused छवियां और lineaging परिणाम तो AceTree का उपयोग कर संपादित कर रहे हैं, जो उपयोगकर्ताओं की पहचान करने के लिए और स्वत: वंशावली StarryNite द्वारा उत्पंन ट्रेस में किसी भी त्रुटियों को ठीक करने की अनुमति देता है । AceTree भी वंश-वृक्ष और 3D मॉडलिंग की renderings के भ्रूण में ट्रैक नाभिक की वर्तमान कर सकते हैं । हम पाते हैं कि ऑटो-lineaging गति और सटीकता स्पष्ट रूप से isotropically संगलित छवियों का उपयोग कर बढ़ाया जाता है, जब या तो spim कैमरा से कच्चे छवियों की तुलना में. हमारे प्रोटोकॉल, जबकि सी. एलिगेंस आवेदन यहां वर्णित के लिए अनुकूलित, आम तौर पर ऑटो के लिए अनुकूलित किया जा सकता है dispim अंय प्रजातियों या नमूनों के लिए उत्पादित डेटा की lineaging । यदि यह प्रोटोकॉल का इच्छित उपयोग है, तो कृपया ध्यान दें कि starrynite मापदंडों के अतिरिक्त ट्यूनिंग की संभावना नए नमूनों के लिए आवश्यक होगा, के रूप में3,4वर्णित है ।
इस प्रोटोकॉल के सफल कार्यांवयन 4d-isotropic संकल्प के साथ छवियों में परिणाम और कोशिकाओं को ट्रेस करने में सक्षम बनाता है जीव, जबकि एक साथ की पहचान करने और विकासशील सी एलिगेंस भ्रूण में ंयूरॉंस का विश्लेषण । इसके अलावा, कई बाद प्रसंस्करण एल्गोरिदम विलय-हार्डवेयर त्वरण के साथ इन सबसे अधिक समय लेने जा रहा है-हम अब दोनों ठीक subcellular विवरण और सेल-lineages और सेल fates का विश्लेषण कर सकते है अनिवार्य रूप से वास्तविक समय में रहते भ्रूण की । इस नए प्रोटोकॉल की अनुमति देता है सटीक, सूचित हेरफेर और निरीक्षण विकि में भिंनता और संरचनाविकास के परिवीथी अध्ययन के दौरान सेल व्यवहार । इस पांडुलिपि में, हम उंनत प्रोटोकॉल हम सी एलिगेंस भ्रूण के विकास में lineaging और सेल ट्रैकिंग, embryogenesis, जीन अभिव्यक्ति या neurodevelopment के अध्ययन को बढ़ाने के लिए विकसित किया है की एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत करते हैं ।
C. एलिगेंस केवल जीव के रूप में अंतिम स्थिति और प्रत्येक वयस्क न्यूरॉन ज्ञात27की कनेक्टिविटी के साथ बाहर खड़ा है. हालांकि, विकास कार्य सर्किट और नेटवर्क है कि ऊपर सी एलिगेंस बनाता है के संगठन के लिए अग्रणी गतिशीलता अनजान रहते हैं । प्रकाश माइक्रोस्कोपी में अग्रिमों से उभरते अवसरों के आधार पर, अब हम पर कब्जा कर सकते हैं और कोशिका की स्थिति, संरचनाउत्पत्ति, और सी एलिगेंस भ्रूणीय विकास भर में न्यूरोजेनेसिस का विश्लेषण ।
प्रक्रिया है कि हम का वर्णन किया है और है कि हम नियमित रूप से प्रयोगशाला में 4, C. एलिगेंस भ्रूण में सेल-lineaging के लिए लेबल ंयूरॉंस और नाभिक के 4 डी-isotropic छवियों पैदावार का उपयोग करें । इससे भी महत्वपूर्ण बात, हम उच्च संकल्प छवियों के साथ dispim और युग्मित अर्द्ध स्वचालित lineaging क्षमताओं के साथ लंबे समय तक इमेजिंग शर्तों अनुकूलित किया है गति और सी एलिगेंस भ्रूणोत्पत्ति का विश्लेषण करने की परिशुद्धता में सुधार होगा । इस एकीकृत प्रोटोकॉल से उपयोगकर्ताओं को कोशिकाओं की पहचान करने और उन्हें पहचानने में मदद मिलेगी और जल्दी फड़कने की शुरुआत के माध्यम से न्यूरोराइट माइग्रेशन और एक्सॉन पूकुलेशन जैसी तीन आयामी विशेषताओं को मापा जा सकेगा । इस प्रक्रिया को आसानी से एक एएसआई diSPIM प्रणाली के साथ किसी भी सुविधा में अनुकूलित किया जा सकता है, और हम इस प्रोटोकॉल के लिए विशेष रूप से इस प्रणाली की सिफारिश । व्यावसायिक रूप से की पेशकश की अन्य SPIM योगों नमूना चैंबर और ऑप्टिकल संपत्तियों में एएसआई विन्यास से अलग हो सकता है. हालांकि, अन्य प्लेटफार्मों से निर्यात किए गए डेटा को भी हमारी डेटा पाइपलाइन के माध्यम से रखा जा सकता है । इसलिए, lineaging, छवि गुणवत्ता और उपकरण स्थिरता की मांग की परीक्षा में उनके मूल्य का मूल्यांकन, व्यवहार्य है । हालांकि हम सक्रिय रूप से diSPIM का उपयोग करने के लिए नियमित रूप से छवि अंय नमूनों (जैसे droवेलु और zebrafish भ्रूण के रूप में), वर्णित और भ्रूण के व्यापक lineaging विश्लेषण अभी भी वर्तमान में सूत्रकृमि प्रजातियों तक ही सीमित है । बड़े या मोटे नमूनों के लिए, हम स्टेज स्कैनिंग दृष्टिकोणों का उपयोग करना चुनते हैं, जो एक स्थिर प्रकाश पत्रक के माध्यम से नमूनों को स्कैन करते हैं । कुमार एट अल. पहले इस सुधार dispim परिच्छेदन को मोटी नमूनों से उच्च dispim10के लिए अतिरिक्त संशोधनों के बिना गुणवत्ता छवियों उपज का प्रदर्शन किया है ।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम पाली-एल-lysine लेपित coverslip पर बढ़ते सी एलिगेंस भ्रूण, डेटा अधिग्रहण, और डेटा प्रोसेसिंग शामिल हैं । कटाई और बढ़ते C. एलिगेंस कांच पर भ्रूणों coverslip अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन यहाँ हम सीखने की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण चरणों का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यदि लंबी अवधि के इमेजिंग वांछित है, हम सबसे अच्छा परिणाम संचयन चार सेल या पहले भ्रूण से 8-10 युवा वयस्कों28प्राप्त करते हैं । ध्यान दें कि पुराने वयस्कों कम प्रारंभिक चरण भ्रूण के लिए वांछनीय है क्योंकि वे गर्भाशय और अनिषेचित अंडे में बड़े भ्रूण होते हैं । बढ़ते भ्रूण के संबंध में, ऐसे इकट्ठे चूषित्र में रुकावट के रूप में समस्याओं (मुंह पिपेट) या एक भी माइक्रोकेशिका पिपेट में एक खोलने के बड़े उचित बढ़ते और भ्रूण के उंमुखीकरण को रोकने सकता है । इष्टतम इमेजिंग के लिए तैयार करने के लिए, हम प्रकाश चादरें, कैमरा, उद्देश्यों, और autofocus के प्रदर्शन की जांच करने के लिए पूर्व और देर से पहले-twitching भ्रूण पर पूर्व अधिग्रहण परीक्षण प्रदर्शन करते हैं । हम सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त जब इन आपरेशनों के सभी परीक्षण कर रहे है और हमारे पूर्व अधिग्रहण परीक्षण के दौरान उच्च गुणवत्ता छवियों उपज । यह विशेष रूप से समदैशिक स्थानिक संकल्प के साथ छवियों को उत्पन्न करने के लिए प्रासंगिक है, जिसके लिए दोनों दृश्यों (उद्देश्यों) से प्राप्त कच्चे चित्र उच्च गुणवत्ता के होने चाहिए । अधिग्रहण के बाद, प्रत्येक दृश्य के लिए अधिग्रहीत संस्करणों समदैशिक छवियों उपज के लिए संसाधित कर रहे हैं । यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक उपयुक्त ग्राफ़िक्स प्रोसेसिंग यूनिट (GPU) कार्ड का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है (नीचे देखें) । यह डेटा विश्लेषण करने के लिए समय छोटा, जिस पर isotropically रूप से संगलित छवियाँ जनरेट किया गया है प्रसंस्करण गति में सुधार करता है । यह भी आवश्यक है कि उपयोगकर्ताओं को CytoSHOW के नवीनतम संस्करण चला रहे है और StarryNite ऑटो के लिए हमारे डाउनलोड बंडल के साथ प्रदान की मापदंडों का उपयोग कर रहे है lineaging । यदि उपयोगकर्ताओं को अंय नमूनों के लिए ऑटो lineaging का उपयोग करने में रुचि रखते है (जैसे, zebrafish, droसोफ़िला आदि) तो starrynite में इस्तेमाल किया मानकों को अतिरिक्त अनुकूलन (संदर्भ3,4देखें) की आवश्यकता होगी ।
हालांकि हमारे एकीकृत प्रोटोकॉल पूर्व-हिल भ्रूण में छवियों और lineaging परिणाम प्रदान करता है, उपयोगकर्ताओं को पता होना चाहिए कि पोस्ट-हिल भ्रूण में स्वचालित lineaging वर्तमान में संभव नहीं है: परमाणु पदों में सेकंड के क्रम पर परिवर्तन बाद-हिल भ्रूण, बहुत तेजी से वंश ट्रैकिंग की अनुमति के लिए । तथापि, dispim वास्तव में एक आशाजनक को neurodevelopmental घटनाओं पर कब्जा करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है और बाद में कुछ सेल पदों को ट्रैक भ्रूणोद्भव के चरणों twitching23,29। यदि उपयोगकर्ताओं के बाद की जांच में रुचि रखते है-हिल भ्रूण, dispim गति प्रदान करने के लिए आयतनी स्नैपशॉट प्राप्त करने और ऐसे neurite outgrowth के रूप में ठीक neurodevelopmental घटनाओं, ट्रैक तेजी से बढ़ भ्रूण में ।
इस प्रोटोकॉल wormguides एटलस30के सेल द्वारा सेल पूरा करने के लिए मूलभूत होगा, क्योंकि यह उच्च संकल्प समदैशिक छवियों के साथ एक एकीकृत दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए की पहचान करने और लेबल ंयूरॉंस के दौरान 3 डी morphologies पर कब्जा होगा embryogenesis के पहले ४३० मिनट । के रूप में यह खड़ा है, प्रोटोटाइप WormGUIDES एटलस विकासशील भ्रूण में कोशिकाओं के परमाणु पदों प्रदान करता है और भ्रूण ंयूरॉंस का एक सबसेट के विकास की गतिशीलता पर कब्जा करना है । इस प्रोटोकॉल WormGUIDES एटलस30में अतिरिक्त विकासशील ंयूरॉंस के एकीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण होगा ।
हमारे इंटीग्रेटेड प्रोटोकॉल के तहत सी एलिगेंस भ्रूण में नए जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल को तलाशना भी आसान होगा । ट्रांसजेनिक सी. एलिगेंसमें, बहुत से कोशिका-विशिष्ट प्रमोटरों ने ट्रांजीन अभिव्यक्ति को बहुत अधिक और सामयिक रूप से नियंत्रित किया है । जबकि अधिकांश जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न बड़े पैमाने पर किया गया है वयस्क पशु में विशेषता31,३२,३३,३४, लगभग सभी अभी तक विकासशील में विशेषता है (विशेष रूप से स्वर्गीय चरण) भ्रूण । C. एलिगेंस प्रोमोटेरोम कृमि समुदाय के लिए एक उपयोगी संसाधन है जो कोशिका-विशिष्ट ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को संचालित करने के साथ-साथ यह भी निर्धारित करेगा कि जीन फलन कोशिका-स्वायत्त या गैर-स्वायत्त है या नहीं । जीनों के आइसोट्रोपिक उच्च संकल्प और गतिशील अभिव्यक्ति पैटर्न पर कब्जा है, और ठीक lineaging के माध्यम से व्यक्त कोशिकाओं की पहचान वैज्ञानिक समुदाय में कई के लिए मूल्यवान हो जाएगा.
भ्रूणोत्पत्ति में दो अंतनमित प्रमुख प्रक्रियाएं, कोशिकीय विभेदन और ऊतक संरचनाजनन शामिल हैं । एक महान सौदा तंत्र और अणुओं है कि सी एलिगेंसके विकास के दौरान विशिष्ट कोशिका प्रकार परिभाषित के बारे में जाना जाता है । हालांकि, थोड़ा कोशिका प्रवास के लिए महत्वपूर्ण तंत्र के बारे में जाना जाता है, सेल आसंजन, और सी एलिगेंस भ्रूण में कोशिका आकार । उदाहरण के लिए, अक्षतंतु पूलिका, synaptogenesis, और न्यूरोनल गतिविधि: C. एलिगेंस अपरिवर्ती कोशिका वंश ज्ञात के साथ, हमारे प्रोटोकॉल हमें आसानी से भ्रूण के सूचीबद्ध 3 डी-माइक्रोएनाटॉमी को पहचानने की सुविधा देता है । आर्डिएल एट अल. पहले सी एलिगेंस भ्रूण23में एक एकल ंयूरॉंस के स्तर पर कैल्शियम यात्रियों पर कब्जा करने के लिए dispim की शक्ति का प्रदर्शन किया है । कई विकास शरीर विज्ञान के अंय पहलुओं इन तरीकों से जांच के लिए परिपक्व हैं ।
अंत में, इस प्रोटोकॉल मोटे तौर पर स्वचालित है और व्यवस्थित समय यह deconvolution छवियों को उत्पन्न करने के लिए लेता है और StarryNite और एसिट्री के माध्यम से सेल-lineaging प्रदर्शन कम कर देता है. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सॉफ्टवेयर रणनीतियों बहुत विशिष्ट क्षेत्रों जिसमें हम उंहें यहां प्रदर्शन किया है से दूर जीव विज्ञान के कई सवालों के लिए लागू किया जा सकता है ।
सॉफ्टवेयर संगतता और डाउनलोड का उपयोग पर विवरण
लघु प्रबंधक और diSPIM इमेजिंग के लिए plugins पर जानकारी http://dispim.org/software/micro-manager और https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin पर उपलब्ध हैं ।
डेटा प्रोसेसिंग पाइपलाइन वर्तमान में एक Windows ऑपरेटिंग सिस्टम की आवश्यकता है । हम सभी आवश्यक डेटा प्रसंस्करण कार्यक्रमों और समर्थन फ़ाइलों की स्थापना को आसान बनाने के लिए एक एकल संग्रह फ़ाइल बंडल है । यह http://dispimlineage.wormguides.org पर डाउनलोड के लिए उपलब्ध है ।
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और खुला स्रोत छवि विश्लेषण मंच, ImageJ (v1) पर आधारित है । जावा स्थापित किया जाना चाहिए और कंप्यूटर पर करने के लिए तारीख CytoSHOW का उपयोग करने के लिए, और CytoSHOW करने के लिए अद्यतन स्वचालित रूप से जावा वेब प्रारंभ के माध्यम से लागू कर रहे हैं । CytoSHOW के कई ImageJ-आधारित कार्यों के रूप में वर्णित है और https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html में सचित्र हैं । CytoSHOW को एएसआई diSPIM, साथ ही अंय इमेजिंग सॉफ्टवेयर है कि झगड़ा उत्पादन बनाता से बहुआयामी कच्चे डेटा प्रदर्शित अनुकूलित किया गया है । सिद्धांत रूप में, अन्य बहु-दृश्य SPIM इमेजिंग सिस्टम इस प्रोटोकॉल अलग माइक्रोस्कोप सिस्टम पर किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए साइटोशो के मामूली संशोधनों के द्वारा समर्थित किया जा सकता है.
SpimFusion में लिखा गया था CUDA/C++ का उपयोग कर Visual Studio २०१३ CUDA टूलकिट v 7.5 के साथ । SpimFusion चल रहा है विशिष्ट कंप्यूटर हार्डवेयर की आवश्यकता है: एक NVIDIA ग्राफिक्स प्रोसेसिंग यूनिट (GPU) कार्ड CUDA १.० या उच्च क्षमता की गणना के साथ और 2 GB ग्राफ़िक्स कार्ड स्मृति की एक ंयूनतम । हमारे प्रोटोकॉल के प्रकाशन के समय, SpimFusion अप्रकाशित (ंयूनतम Guo और हरि श्रॉफ) है, लेकिन ऊपर उल्लेख सॉफ्टवेयर बंडल संग्रह में उपलब्ध है ।
एक विशेष रूप से निर्मित StarryNite के कमांड लाइन चालित संस्करण की आवश्यकता है कि आज़ादी से उपलब्ध MATLAB संकलक रनटाइम स्थापित है, लेकिन वाणिज्यिक MATLAB सॉफ्टवेयर के लिए एक लाइसेंस की आवश्यकता नहीं है । MATLAB संकलक रनटाइम सॉफ्टवेयर बंडल ऊपर उल्लेख संग्रह में शामिल है । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल के रूप में starrynite के लिए कोड अनिवार्य रूप से संनाभि छवियों6के लिए इस्तेमाल किया है कि से अपरिवर्तित है । हालांकि, StarryNite प्रसंस्करण के लिए इनपुट छवियों के निर्माण में कई परिचालन मामलों और StarryNite परिणामों की हैंडलिंग यहां साइटोशो में तरीकों से संबोधित किया गया है कि एक सतत डेटा प्रोसेसिंग पाइप लाइन के लिए इस्तेमाल किया आइसोट्रोपिक diSPIM वॉल्यूम. इन परिवर्तनों को साइटोशो कोड द्वारा स्वचालित कर रहे है जो इन पूर्व और पोस्ट-प्रोसेसिंग चरणों को संभालता है । कोशिका प्रदर्शन भी एक पूर्व अनुकूलित diSPIM-विशिष्ट टेम्पलेट StarryNite पैरामीटर सेट स्वचालित रूप से imaged डेटा में नाभिक की प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए विभाजन एल्गोरिथ्म ट्यून करने के लिए । अद्वितीय प्रत्येक diSPIM डेटा सेट पर StarryNite द्वारा इस्तेमाल किया पैरामीटर तो उत्पादन छवि और lineaging डेटा के साथ एक फ़ाइल में सहेज कर रहे हैं ।
एसिट्री का एक कस्टम संस्करण है कि 16 बिट छवियों के साथ काम करता है और Java3D प्रतिपादन के साथ संगतता बनाए रखता है सबसे अच्छा इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है. यह भी ऊपर उल्लेख सॉफ्टवेयर बंडल संग्रह में शामिल है ।
The authors have nothing to disclose.
हम एकीकृत तनाव, ujIs113 के लिए जॉन मरे धंयवाद, lineaging तनाव BV514 उत्पंन; ब्रेंडन हार्वे (NIBIB) प्रोटोकॉल के परीक्षण के साथ मदद के लिए; जॉन डेनियल और गैरी Rondeau (एप्लाइड वैज्ञानिक इंस्ट्रूमेंटेशन) माइक्रो प्रबंधक और diSPIM उपकरण के साथ सहायता के लिए; और एंड्रयू ंयूयार्क और हांक ईडन diSPIM प्रणाली पर उनके महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया के लिए । हम भी अल्पसंख्यक संस्थानों कार्यक्रम के लिए अनुसंधान केंद्र और Instituto de Neurobiología जोस डेल Castillo धंयवाद (Universidad de Puerto रीको) एक बैठक और मंच बुद्धिशीलता प्रदान करने के लिए । इस काम के अधिकांश Whitman कार्यक्रम के माध्यम से वुड्स होल में समुद्री जैविक प्रयोगशाला में आयोजित किया गया । यह काम NIH राष्ट्रीय जैव चिकित्सा इमेजिंग और Bioengineering संस्थान के Intramural अनुसंधान कार्यक्रमों और NIH अनुदान नहीं द्वारा समर्थित किया गया । U01-HD075602 और नहीं । R24-OD016474 । मार्क डब्ल्यू Moyle F32 द्वारा समर्थित-NS098616 और Leighton एच Duncan R24-OD016474 के लिए एक विविधता के पूरक द्वारा समर्थित किया गया था ।
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |