Her presenterer vi en Kombinatorisk tilnærming ved hjelp av høyoppløselig mikroskopi, beregningsorientert verktøy, og enkelt celle merkingsteknikker i å leve C. elegans embryo å forstå enkelt celle dynamikk under neurodevelopment.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) skiller seg ut som den eneste organismen der utfordringen med å forstå mobilnettet opprinnelsen til en hel nervesystemet kan observeres, med én celle oppløsning, in vivo. Her presenterer vi en integrert protokoll for undersøkelse av neurodevelopment i C. elegans embryo. Vår protokoll kombinerer Imaging, lineaging og nevroanatomi sporing av enkeltceller i å utvikle embryo. Vi oppnår langsiktige, fire-dimensjonale (4D) avbildning av levende C. elegans embryo med nesten isotropic romlig oppløsning gjennom bruk av dual-View invertert selektiv Plane belysning mikroskopi (diSPIM). Kjerner og neuronal strukturer i nematode embryo er avbildet og isotropically smeltet for å gi bilder med oppløsning på ~ 330 NM i alle tre dimensjoner. Disse minutt-for-minutt høyoppløselige 4D datasett blir deretter analysert for å relatere definitive celle-avstamning identiteter med genuttrykk og morfologiske dynamikk på single-celle og subcellulære nivåer av detaljer. Vår protokoll er strukturert for å muliggjøre modulær implementering av hver av de beskrevne trinnene og forbedre studier på embryogenesis, genuttrykk eller neurodevelopment.
C. elegans skiller seg ut som den eneste organismen der hver celle i fosteret kan observeres gjennom neurodevelopment. Med hele celle-avstamning kjent og invariant1, og med utviklingen av nye verktøy som tillater merking og kontinuerlig bildebehandling av enkeltceller i embryo, biologer kan nå begynne å undersøke ulike trinn i utviklingen av nematode nervøs system fra alle vinkler-celle fødsel; migrasjon og differensiering; neurite formasjon, målrettede utvekst og fasciculation; synapse formasjon; og tuning av funksjonelle kretser. Fange neuronal utvekst dynamikk i C. elegans embryo, ved å kombinere stabilt uttrykt journalister og fluorescens mikroskopi, er verdifullt for det vitenskapelige samfunnet.
Utviklingsstudier i C. elegans ofte utnytter invariant celle-avstamning og celle-skjebne kart av denne arten å øke kontekstuell forståelse på enkelt cellenivå i intakt organisme1. Auto-lineaging analyse-bruke StarryNite2,3,4 og AceTree5,6,7,8 programvare-fordeler fra høy kontrast, høy oppløsning bilder av fluorescerende kjerner. For å fungere optimalt, StarryNite/AceTree også avhengig av forutsigbar begrenset orientering av avbildet embryo under utvikling. Konfokalmikroskopi mikroskopi, gjort i C. elegans embryo komprimert mellom to coverslips, har vært standard Auto-lineaging mikroskopi metode for mer enn et ti år fordi det gir både høy kontrast/høy oppløsning og en forutsigbar begrenset orientering av embryo7,8. Vi har tidligere beskrevet bygging og bruk av en roman lys-ark-baserte dual-View invertert selektiv flyet belysning mikroskop (diSPIM) for Live sample Imaging som C. elegans embryogenesis9,10 , 11 flere , 12 flere , 13. lys-ark mikroskopi, generelt, gir lav Phototoksisitet, høy hastighet, og langsiktig Imaging av levende 3D prøver14,15. Den diSPIM metoden, spesielt, produserer fire-dimensjonale (4D) bilder med nesten isotropic romlig oppløsning på ca 330 NM9.
Sammenlignet med konfokalmikroskopi mikroskopi, tilbyr diSPIM høyere signal-til-støy og hastighet, mer isotropic romlig oppløsning, og er mer egnet for langsiktig in vivo Imaging16. Derfor arbeidet vi med å tilpasse diSPIM data for innspill til StarryNite/AceTree og undersøke om dette ville forsterke lineaging analysene. Et stort hinder er at diSPIM prøver kan ikke være lett begrenset av eggeskall-komprimering for å vedta forventet orientering for StarryNite/AceTree. Random orientering av celle posisjoner i volumet blir analysert forringer nøyaktigheten av Auto-lineaging analyse.
Vi derfor ansatt CytoSHOW, en seer-guidet bruker grenseflate hvilke innrømmer brukernes å velge akkurat 3D orienteringen av embryo i løpet av pre-bearbeiding av diSPIM profilen, gir image data det er begge to kvalitet-optimert og sammenheng-våken for input i StarryNite /AceTree. Ved bruker-valg av avbildet embryo, CytoSHOW appartefakter en automatisert databehandling rørledning. Bilder som trekkes ut og er trukket i bakgrunnen, lagres i TIFF-stack-filer for hver posisjon, timepoint og visning. CytoSHOW så iteratively kaller programmet SpimFusion å co-register og i fellesskap deconvolve de to pre-bearbeidet synspunkter, ved hjelp av Richardson-Lucy17,18 algoritme for å gi isotropic høyoppløselig volum bilder. En diSPIM-spesifikt sett med parametere er optimalisert for StarryNite å styre sin oppførsel under bilde-segmentering og nucleus-sporing i isotropically smeltet bilder. Smeltet bilder og lineaging resultatene blir deretter redigert ved hjelp AceTree, som tillater brukere å identifisere og fikse eventuelle feil i Auto-avstamning spor generert av StarryNite. AceTree kan også kan presentere avstamning-tre og 3D-modellerte gjengivelser av sporede kjerner i fosteret. Vi finner at Auto-lineaging hastighet og nøyaktighet er markert forbedret ved hjelp av isotropically smeltet bilder, sammenlignet med rå bilder fra enten SPIM kamera. Vår protokoll, mens optimalisert for C. elegans programmet beskrevet her, kan være generelt tilpasset for Auto-Lineaging av diSPIM data produsert for andre arter eller prøver. Hvis dette er den tiltenkte bruken av protokollen, Vær oppmerksom på at ytterligere tuning av StarryNite parametrene vil trolig være nødvendig for nye eksemplarer, som beskrevet3,4.
Vellykket gjennomføring av denne protokollen resulterer i bilder med 4D-isotropic oppløsning og lar biologer spore cellelinjene, samtidig identifisere og analysere neurons i utviklingsland C. elegans embryo. Videre, ved å slå sammen flere etterbehandling algoritmer-med hardware akselerasjon er den mest tidkrevende av disse-vi kan nå analysere både fine subcellulære detaljer og celle-linjene og celle-skjebne levende embryo i hovedsak sanntid. Denne nye protokollen gir presis, informert manipulasjon og observasjon av celle atferd under probative studier av differensiering og morphogenesis in vivo. I dette manuskriptet presenterer vi en detaljert forklaring av de forbedrede protokollene vi har utviklet for lineaging og celle sporing i utviklingen av C. elegans embryo, for å forbedre studier av embryogenesis, genuttrykk eller neurodevelopment.
C. elegans skiller seg ut som den eneste organismen med den endelige posisjoner og tilkobling av hver voksen Nevron kjent27. Men den utviklingsmessige dynamikken fører til organisering av arbeider kretser og nettverk som utgjør C. elegans connectome forblir ukjent. Basert på muligheter som kommer ut av fremskritt innen lys mikroskopi, kan vi nå fange opp og analysere celle posisjoner, morphogenesis og neurogenesis gjennom hele C. elegans embryoutvikling.
Prosedyren som vi har beskrevet og at vi rutinemessig bruk i laboratoriet gir 4D-isotropic bilder av merkede neurons og kjerner for celle-lineaging i C. elegans embryo. Enda viktigere, vi har optimalisert langsiktige Imaging forhold med diSPIM og kombinert semi-automatiserte lineaging evner med høyoppløselige bilder for å forbedre hastigheten og presisjonen av å analysere C. elegans embryogenesis. Denne integrert protokollen ville sette i stand brukernes å visualisere og identifisere celler og quantitate tre-dimensjonale vise egenskaper som neurite Migration og axon fasciculation igjennom utbruddet av tidlig beveger. Denne fremgangsmåten kan lett tilpasses alle anlegg med et ASI diSPIM-system, og vi anbefaler dette systemet spesielt for denne protokollen. Andre SPIM-formuleringer som tilbys kommersielt kan avvike fra ASI-konfigurasjonen i prøvekammeret og de optiske egenskapene. Data som eksporteres fra andre plattformer, kan imidlertid også legges gjennom datasamlebåndet. Derfor er vurdering av deres verdi i lineaging, en krevende test av bildekvalitet og instrument stabilitet, gjennomførbart. Selv om vi aktivt bruker diSPIM å regelmessig bilde andre eksemplarer (for eksempel Drosophila og sebrafisk embryo), den beskrevne og omfattende lineaging analyse av embryo er fortsatt for tiden begrenset til nematode arter. For større eller tykke prøver, velger vi å bruke scene-skanning tilnærminger, som skanner prøvene gjennom en stasjonær lys ark. Kumar et al. har tidligere demonstrert denne forbedrede diSPIM-snitting for å gi bilder av høy kvalitet fra tykke prøver uten ytterligere modifikasjoner på diSPIM10.
De kritiske trinnene i protokollen inkluderer montering C. elegans embryo på Poly-L-lysin belagt dekkglass, datainnsamling, og databehandling. Høsting og montering C. elegans embryo på glass dekkglass kan være utfordrende for uerfarne brukere, men her gir vi en detaljert protokoll av viktige trinn for å lette læringen. Hvis langsiktige Imaging er ønsket, får vi best resultat høsting fire-celle eller tidligere embryo fra 8-10 unge voksne28. Merk at gamle voksne er mindre ønskelig å høste tidlig stadium embryo fordi de har en tendens til å inneholde eldre embryo i livmoren og ubefruktede egg. I forhold til montering embryo, problemer som blokkering i den sammensatte aspirator (munn pipette) eller en altfor stor av en åpning i microcapillary pipette kan hindre riktig montering og orientering av embryo. For å forberede for optimal bildebehandling, utfører vi pre-oppkjøpet testing på tidlig og sent pre-rykninger embryo å sjekke ytelsen til lys ark, kameraer, mål og autofokus. Vi får best resultat når alle disse operasjonene er testet og gir bilder av høy kvalitet i løpet av vår pre-oppkjøpet testing. Dette er spesielt relevant for generering av bilder med isotropic romlig oppløsning, der rå bilder ervervet fra begge visningene (målsettinger) må være av høy kvalitet. Etter oppkjøpet blir volumene som er ervervet for hver visning, behandlet for å gi isotropic bilder. Det er viktig å bruke et riktig grafikkort (GPU) som beskrevet i denne protokollen (se nedenfor). Dette forbedrer behandlingshastigheten som isotropically smeltet bilder genereres, forkorte tiden til dataanalyser. Det er også viktig at brukerne kjører den nyeste versjonen av CytoSHOW og bruker parametrene som følger med vår nedlasting bunt for StarryNite Auto-lineaging. Hvis brukere er interessert i å bruke auto-lineaging for andre prøver (f.eks. sebrafisk, Drosophila osv.), vil ytterligere optimering av parametrene som brukes i StarryNite være nødvendig (se referanser3,4).
Selv om våre integrerte protokollen gir bilder og lineaging resultater i pre-rykninger embryo, brukere bør være klar over at automatiserte lineaging i post-rykninger embryo er ikke gjennomførbart: kjernefysiske posisjoner endringer på rekkefølgen av sekunder i post-rykninger embryo, for raskt å tillate avstamning sporing. Imidlertid har diSPIM faktisk vist en lovende evne til å fange neurodevelopmental hendelser og spore noen celle posisjoner i de post-rykninger stadier av embryogenesis23,29. Hvis brukerne er interessert i å undersøke post-rykninger embryo, den diSPIM gir hastigheten for å få volum øyeblikksbilder og spore fine neurodevelopmental hendelser, for eksempel neurite utvekst, i raskt bevegelige embryo.
Denne protokollen vil være grunnleggende for celle-for-celle ferdigstillelse av WormGUIDES Atlas30, som det vil gi en integrert tilnærming med høy oppløsning isotropic bilder for å identifisere og fange 3D morfologier av merkede neurons under de første 430 minuttene av embryogenesis. Som det står, prototypen WormGUIDES Atlas gir kjernefysiske posisjoner av celler i utviklingsland embryo og har som mål å fange den utviklingsmessige dynamikken i en undergruppe av embryonale neurons. Denne protokollen vil være en nøkkel for integrering av ytterligere utvikle neurons i WormGUIDES Atlas30.
Vår integrerte protokoll vil også forenkle utforskningen av nye gen uttrykks profiler i C. elegans embryo. I transgene C. elegans, mange celle-spesifikke arrangører romlig og timelig kontroll transgene uttrykk. Mens uttrykket mønstre av de fleste gener har vært omfattende preget i den voksne dyret31,32,33,34, nesten alle har ennå ikke vært preget i utviklingsland (spesielt sen-Stage) embryo. C. elegans promoterome har vært en nyttig ressurs for ormen samfunnet å kjøre celle-spesifikke transgene uttrykk, samt avgjøre om gen funksjonen er celle-autonome eller ikke-autonome. Fange isotropic høyoppløselig og dynamisk uttrykk mønstre av gener, og presist identifisere uttrykke celler via lineaging vil være verdifullt for mange i det vitenskapelige samfunnet.
Embryogenesis består av to sammenflettede store prosesser, cellulær differensiering og vev morphogenesis. En god del er kjent om mekanismer og molekyler som definerer forskjellige celletyper under utviklingen av C. elegans. Men lite er kjent om mekanismene viktig for celle migrasjon, celle vedheft, og celle form i C. elegans embryo. Med C. elegans invariant celle avstamning kjent, vår protokoll lar oss lett skjelne katalogisert 3D-microanatomy av fosteret under morphogenesis på nye nivåer av detaljer: for eksempel, axon fasciculation, synaptogenesis, og neuronal aktivitet. Ardiel et al. har tidligere demonstrert kraften i diSPIM å fange kalsium transienter på nivå med en enkelt neurons i C. elegans embryo23. Mange andre aspekter av utviklings fysiologi er moden for undersøkelse av disse metodene.
Til slutt, denne protokollen er i stor grad automatisert og systematisk reduserer tiden det tar å generere deconvolution bilder og utføre celle-lineaging via StarryNite og Acetree. Programvaren strategiene som brukes i denne protokollen kan brukes på mange spørsmål om biologi fjernt fra de svært spesifikke felt der vi har vist dem her.
Detaljer om programvare kompatibilitet og nedlasting tilgang
Informasjon om Micro-Manager og plugins for diSPIM Imaging er tilgjengelig på http://dispim.org/software/micro-manager og https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
Pipeline for databehandling krever for øyeblikket et Windows-operativsystem. Vi har samlet en enkelt arkiv fil for å forenkle installasjonen av alle nødvendige data-prosessering programmer og støttefiler. Den er tilgjengelig for nedlasting på http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) er basert på mye brukt og åpen kildekode bildeanalyse plattform, ImageJ (v1). Java må være installert og oppdatert på datamaskinen for å bruke CytoSHOW, og oppdateringer til CytoSHOW distribueres automatisk via Java Web Start. Mange ImageJ-baserte funksjoner i CytoSHOW er som beskrevet og illustrert på https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW har blitt tilpasset for å vise flerdimensjonale rådata fra ASI diSPIM, samt annen tenkelig programvare som skaper TIFF-utdata. I prinsippet kan andre multi-View SPIM Imaging systemer støttes av mindre modifikasjoner av CytoSHOW å tillate denne protokollen skal utføres på ulike mikroskop systemer.
SpimFusion ble skrevet i CUDA/C++ ved hjelp av Visual Studio 2013 med CUDA Toolkit v 7.5. Running SpimFusion krever spesifikk maskinvare: et NVIDIA-grafikkort (GPU) med CUDA databehandlings funksjon 1,0 eller høyere og minimum 2 GB grafikkort minne. På tidspunktet for utgivelsen av vår protokoll, SpimFusion er upublisert (min Guo og Hari Shroff), men tilgjengelig i programvaren bunt arkivet nevnt ovenfor.
En spesielt bygget kommandere-line kjørt versjon av StarryNite behøver det det fritt anvendelig MATLAB kompilatoren Runtime er installert, bortsett fra er ikke forlange en med lisens for reklamen MATLAB programvare. Den MATLAB Compiler Runtime er inkludert i programvaren bunt arkivet nevnt ovenfor. Koden for StarryNite som brukes i denne protokollen er i hovedsak uendret fra den som brukes for konfokalmikroskopi bilder6. Imidlertid har flere operative saker i etableringen av innspill bilder for StarryNite prosessering og håndtering av StarryNite resultater er adressert her ved metoder i CytoSHOW som muliggjør en kontinuerlig databehandling rørledning for smeltet isotropic diSPIM Volumer. Disse endringene er automatisert av CytoSHOW kode som håndterer disse pre-og post-prosessering trinn. CytoSHOW også redigerer en pre-optimalisert diSPIM-spesifikke mal StarryNite parameter satt til å automatisk tune den segmentering algoritmen til fluorescens intensiteten av kjerner i avbildet data. De unike parametrene som brukes av StarryNite på hvert diSPIM datasett blir deretter lagret i en fil sammen med output image og lineaging data.
En tilpasset versjon av AceTree som fungerer med 16-bits bilder og opprettholder kompatibilitet med Java3D rendering er best egnet for denne protokollen. Det er også inkludert i programvaren bunt arkivet nevnt ovenfor.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker John Murray for integrert belastning, ujIs113, å generere lineaging stamme BV514; Brandon Harvey (NIBIB) for å få hjelp til å teste protokollen; Jon danske og Gary Rondeau (anvendt naturvitenskapelig Instrumentation) for assistanse med mikro–bestyrer og diSPIM apparat; og Andrew York og Hank Eden for deres kritiske tilbakemeldinger på diSPIM systemet. Vi takker også Research Center for minoritets institusjoner programmet og Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) for å gi et møte og brainstorming plattform. Mye av dette arbeidet ble gjennomført ved Marine biologiske laboratorium i Woods Hole gjennom Whitman program. Dette arbeidet ble støttet av intramural Research Programs i NIH National Institute of Biomedical Imaging and bioteknologi og ved NIH Grant nei. U01-HD075602 og nei. R24-OD016474. Markus W. Moyle ble støttet av F32-NS098616 og Leighton H. Duncan ble støttet av et mangfold supplement til R24-OD016474.
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |