In vivo Intracerebrale Stereotaxic injeksjoner for Optogenetic stimulering av langtrekkende innganger i mus Brain skiver
Summary
Denne protokollen beskriver et sett med metoder for å identifisere den celle-type spesifikke funksjonell tilkobling av langtrekkende innganger fra fjerne hjernen områder ved hjelp optogenetic stimuleringer i ex vivo hjerne skiver.
Abstract
Kjennskap til celle-type spesifikke Synaptic tilkobling er en avgjørende forutsetning for å forstå hjernen hele neuronal kretser. Den funksjonelle etterforskningen av langtrekkende forbindelser krever målrettede innspillinger av enkelt neurons kombinert med den spesifikke stimulering av identifiserte fjerne innganger. Dette er ofte vanskelig å oppnå med konvensjonelle og elektriske stimulering teknikker, fordi axons fra sammenfallende oppstrøms hjerneområder kan blander i målregionen. Den stereotaxic målretting av en bestemt hjerne regionen for virus-mediert uttrykk for lys-sensitive ion kanaler tillater selektiv stimulering av axons som stammer fra den regionen med lys. Intracerebrale stereotaxic injeksjoner kan brukes i godt avgrenset strukturer, slik som fremre thalamic kjerner, i tillegg til andre subkortikal eller kortikale områder i hele hjernen.
Beskrevet her er et sett av teknikker for presis stereotaxic injeksjon av viral vektorer uttrykker channelrhodopsin i musen hjernen, etterfulgt av photostimulation av axon terminaler i hjernen Slice forberedelse. Disse protokollene er enkel og vidt anvendelig. I kombinasjon med hel celle patch klemme opptak fra en postsynaptically koblet Nevron, photostimulation av axons tillater påvisning av funksjonelle Synaptic tilkoblinger, farmakologiske karakterisering, og evaluering av deres styrke. I tillegg kan biocytin fylling av den innspilte Nevron brukes for post-hoc morfologiske identifisering av postsynaptic Nevron.
Introduction
Definere tilkobling mellom hjernen regioner er nødvendig for å forstå nevrale kretser. Klassiske anatomiske tracing metoder tillate etablering interregionale tilkobling, og lesjon studier bidra til å forstå den hierarkiske organiseringen av informasjonsflyt. For eksempel, hjerne kretser for romlig orientering og hodet retning signalering innebære retningsbestemt flyt av informasjon fra thalamus til presubiculum. Dette har blitt demonstrert av lesjon studier av Antero-rygg thalamic kjerner (ADN) som forringer hodet retning signalet i nedstrøms rygg presubiculum, samt parahippocampal rutenettcelle signal1,2.
Den funksjonelle forbindelsen mellom hjerneområder er vanskeligere å etablere på et mobil-og subcellulære nivå. I hippocampus, en svært organisert anatomi gjør det mulig å undersøke Pathway-spesifikke Synaptic tilkoblinger ved hjelp av elektrisk simulering i stykket forberedelse. Stimulering elektroder plassert i stratum radiatum av CA1 kan brukes til å spesielt stimulere Schaffer sikkerhet innspill fra CA33. Stimulerende elektroder plassert i stratum lacunosum moleculare av CA1 vil aktivere perforant banen input til CA14,5. Elektrisk stimulering aktiverer signal utslipp fra axon terminaler; men aktiverer den neurons med somata nær stimulering området samt axons av passasjen. Det er derfor av begrenset bruk for å studere afferents fra definerte hjerneområder når fibrene i ulike regioner av opprinnelse blander i mål strukturen, som typisk er tilfellet i mektig.
Neurons kan også stimuleres med lys. Optiske metoder inkluderer photoactivation av bur glutamat, som kan kombineres med en-eller to-Foton laserskanning. Flere tett linjeavstand områder kan bli stimulert sekvensielt, uten mekaniske skader på vevet6. Dette har blitt brukt til å kartlegge Synaptic reseptorer samt aktivere individuelle neurons7. Selv om glutamat uncaging kan brukes til lokal krets analyse, tillater den ikke for spesifikk aktivering av langtrekkende innganger.
En metode for valg for etterforskning av langtrekkende tilkobling i neuronal kretser er bruken av virus-mediert channelrhodopsin uttrykk. Bruke in vivo stereotaxic injeksjoner som beskrevet her, kan uttrykket av lys-gated ion kanaler være målrettet og romlig begrenset til en ønsket hjerne regionen. På denne måten er channelrhodopsins effektive for kartlegging av eksitatoriske eller hemmende tilkobling fra en region til målet. Transfekterte axons terminaler kan stimuleres med lys i en hjerne Slice forberedelse, og patch-klemme innspillinger som en lese-out tillate undersøkelse av funksjoner og sterke sider av spesifikke krets komponenter i hjernen8. Den optogenetic tilnærmingen kombinert med stereotaxic injeksjon av et virus tilbyr enestående spesifisitet og genetisk kontroll9. Stimulere med lys i tillegg gjør det mulig for både høy Temporal og romlig presisjon10,11.
Den presubiculum er en seks-lags kortikale struktur ved overgangen av hippocampus og para-hippocampus formasjon12,13. Det mottar viktig Synaptic innspill fra ADN11 , men også fra flere andre kortikale og subkortikal regioner14. Dermed er selektiv stimulering av thalamic axons terminaler i en presubicular skive ikke mulig med elektrisk stimulering eller glutamat uncaging. Beskrevet i denne protokollen er metoder for å bestemme funksjonell tilkobling mellom hjernen regioner (ADN og presubiculum) ved hjelp av presise stereotaxic injeksjoner av viral vektorer uttrykker lys-gated kanaler. Også beskrevet er photostimulation av axons terminaler med prosjektering neurons i deres målregion, kombinert med hele cellen patch-klemme innspillinger av post-Synaptic neurons i hjernen Slice forberedelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo viral injeksjon for å uttrykke lys-sensitive opsins i et definert hjerne område er en valg metode for optogenetic analyse av langtrekkende funksjonell tilkobling10,11,17,18. Stereotaxic injeksjoner tilbyr muligheten til å nøyaktig målrette et bestemt område av hjernen. Coexpression av en opsin med en fluorescerende reporter beleilig tillater evaluering av vellykket uttrykk og bekr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang, og Jean Simonnet for deres hjelp i utviklingen av tidligere versjoner av stereotaxic injeksjon protokollen og marin Manuel og Patrice Jegouzo for teknisk hjelp. Dette arbeidet ble støttet av det franske departement for utdanning og forskning (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.), og Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
