JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Isolering av Lipoproteinpartiklar från kyckling äggula för studiet av bakteriell patogen fettsyra inkorporering i Membranfosfolipider

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

Denna metod ger en ram för att studera inkorporering av exogena fettsyror från komplexa värd källor till bakterie membran, särskilt Staphylococcus aureus. För att uppnå detta beskrivs protokoll för berikning av lipoproteinpartiklar från kyckling äggula och efterföljande fettsyra profilering av bakteriella fosfolipider som utnyttjar masspektrometri.

Abstract

Staphylococcus aureus och andra grampositiva patogener inkorporerar fettsyror från miljön i membranfosfolipider. Under infektion, majoriteten av exogena fettsyror är närvarande inom värd lipoprotein partiklar. Osäkerheten kvarstår när det gäller reservoarerna av värd fettsyror och de mekanismer genom vilka bakterier extraherar fettsyror från lipoproteinpartiklarna. I detta arbete beskriver vi protokoll för berikning av Low-density lipoprotein (LDL) partiklar från kyckling äggula och avgöra om LDLs tjäna som fettsyror reservoarer för S. aureus. Denna metod utnyttjar förutsättningslös lipidomikprofildata analys och kyckling LDLs, en effektiv och ekonomisk modell för utforskning av interaktioner mellan LDLs och bakterier. Analysen av S. aureus integration av exogena fettsyror från LDLs utförs med hjälp av högupplöst/noggrann masspektrometri och tandem masspektrometri, vilket gör det möjligt att karakterisera fettsyrorna sammansättningen av bakterien membran och opartisk identifiering av nya kombinationer av fettsyror som uppstår i bakteriella membran lipider vid exponering för LDLs. Dessa avancerade masspektrometri tekniker erbjuder ett oöverträffat perspektiv av fettsyra inkorporering genom att avslöja de specifika exogena fettsyror som ingår i fosfolipider. De metoder som beskrivs här är anpassningsbara till studiet av andra bakteriella patogener och alternativa källor till komplexa fettsyror.

Introduction

Meticillinresistenta S. aureus (MRSA) är den vanligaste orsaken till vårdrelaterade infektioner och tillhörande antibiotikaresistens är en avsevärd klinisk utmaning1,2,3. Därför är utvecklingen av nya terapeutiska strategier en hög prioritet. En lovande behandlingsstrategi för grampositiva patogener hämmar fettsyror syntes, ett krav för membran fosfolipid produktion som, i S. aureus, innehåller fosfatidylglycerol (PG), lysyl-PG, och kardiolipin4. I bakterier sker produktionen av fettsyror via fettsyra syntes II-vägen (fasII)5, som skiljer sig avsevärt från den eukaryotiska motsvarigheten, vilket gör fasII till ett attraktivt mål för antibiotika utveckling5,6 . FASII-hämmare riktar sig främst till FabI, ett enzym som krävs för kedje förlängning av fettsyror7. Den Fabi-hämmare triclosan används i stor utsträckning i konsument-och medicintekniska produkter8,9. Ytterligare Fabi-hämmare utvecklas av flera läkemedelsföretag för behandling av infektion med S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Emellertid, många grampositiva patogener, inklusive S. aureus, kan rensa exogena fettsyror för fosfolipid syntes, förbigående fasII hämning27,28,29. Således är den kliniska potentialen för fasII-hämmare diskuteras på grund av stora luckor i vår kunskap om källorna till värd fettsyror och de mekanismer genom vilka patogener extrahera fettsyror från värd27,28. För att ta itu med dessa luckor, vi utvecklat en opartisk lipidomikprofildata analysmetod för att övervaka införlivandet av exogena fettsyror från lipoprotein partiklar i membran fosfolipider av S. aureus.

Under sepsis, värd lipoprotein partiklar utgör en potentiell källa av värd-härledda fettsyror inom kärl sammandrabliden, som en majoritet av värd fettsyror är förknippade med partiklarna30. Lipoproteiner består av ett hydrofila skal bestående av fosfolipider och proteiner som omger en hydrofoba kärna av triglycerider och kolesterolestrar31. Fyra stora klasser av lipoproteiner–chylomicron, mycket low-density lipoprotein, hög densitet lipoprotein, och low-density lipoprotein (LDL)-produceras av värden och fungerar som lipid transport fordon, leverera fettsyror och kolesterol till och från värdceller via vaskulaturen. LDLs är rikligt i förestrade fettsyror inklusive triglycerider och kolesterolestrar31. Vi har tidigare visat att högt renade mänskliga LDLs är en livskraftig källa till exogena fettsyror för PG-syntes, vilket ger en mekanism för FASII hämmare bypass32. Rena mänskliga LDLs kan vara tekniskt utmanande och tidskrävande medan kommersiella källor av renade mänskliga LDLs är oöverkomligt dyra att använda rutinmässigt eller att utföra storskaliga bakteriella skärmar. För att åtgärda dessa begränsningar har vi ändrat ett förfarande för berikning av LDL från kyckling äggula, en rik källa av lipoprotein partiklar33. Vi har framgångsrikt använt oriktad, högupplöst/noggrann masspektrometri och tandem masspektrometri för att övervaka införlivandet av humana LDL-härledda fettsyror i membranet i S. aureus32. Till skillnad från tidigare rapporterade metoder, denna metod kan kvantifiera enskilda fettsyror isomerer för var och en av de tre stora staphylococcal fosfolipid typer. Oljesyra (18:1) är en omättad fettsyra närvarande inom alla värd lipoprotein partiklar som är lätt införlivas i S. aureus fosfolipider29,30,32. S. aureus är inte kapabel av oljesyra syntes29; Därför etablerar mängden fosfolipid-inkorporerade oljesyra förekomsten av värd lipoprotein-härledda fettsyror i stafylokockmembranet29. Dessa fosfolipid arter kan identifieras genom den State-of-the-art masspektrometri metod som beskrivs här, erbjuder oöverträffad upplösning av membranet sammansättningen av S. aureus odlade i närvaro av en fettsyra källa det sannolikt möten under infektion.

Protocol

Anmärkning: följande protokoll för berikning av LDL-partiklar från kyckling äggula härrör från Moussa et al. 200233. 1. beredning av kyckling äggula för berikning av LDL-partiklar Sanitize två stora hönsägg genom att tvätta skalen med 70% etanollösning och låt lufttorka. Sanitize ägget separatorn med 70% etanollösning och låt lufttorka. Fäst ägg avskiljaren på läppen på en medelstor bägare. Spricka varje ägg indivi…

Representative Results

Protokollet för berikning av LDL från kyckling äggula illustreras i figur 1. Denna process inleds genom att späda hela äggula med saltlösning och separera äggula fasta ämnen som betecknas som granulat från den lösliga eller plasma fraktion som innehåller LDLs (figur 1)33. LDL-halten i plasma fraktionen berikas ytterligare genom utfällning av ~ 30-40 kDa β-livetiner (figur …

Discussion

S. aureus innehåller exogena fettsyror i dess membran fosfolipider27,32,43. Fosfolipidsyntes med exogena fettsyror kringgår fasII-hämning men förändrar även de biofysiska egenskaperna hos membranet27,32,44. Även om införlivandet av exogena fettsyror i fosfolipider av grampositiva patogener är väl dokumenterat, kvarst?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar medlemmar i Hammer Laboratory för deras kritiska utvärdering av manuskriptet och stöd för detta arbete. Dr Alex Horswill vid University of Colorado School of Medicine vänligt förutsatt AH1263. Dr Chris Waters laboratorium vid Michigan State University förutsatt reagenser. Detta arbete stöddes av American Heart Association Grant 16SDG30170026 och start-up medel ger av Michigan State University.

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts – Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Keywords: Lipoprotein ParticlesChicken Egg YolkBacterial PathogenFatty Acid IncorporationMembrane PhospholipidsLipidomic AnalysisStaphylococcus AureusAmmonium SulfateDialysis
check_url/59538?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image