O objetivo deste protocolo é genótipo o vectensis do nematostella do Anemone de mar durante o gastrulação sem sacrificar o embrião.
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Artigo de método
Genotyping de Anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado
Neste artigo
Resumo
Resumo
Descrito aqui é um protocolo PCR-baseado para genótipo o embrião do estágio do gástrula do vectensis cnidários cnidários do nematostella sem sacrificar a vida do animal. Após a fertilização in vitro e de-jellying, zigítos são autorizados a desenvolver por 24 h à temperatura ambiente para chegar ao estágio inicial-a meados de gastrula. Os embriões do gástrula são coloc então em uma cama do gel do agarose em um prato de Petri que contem o seawater. o microscópio de dissecação, uma agulha de tungstênio é usada para separar cirurgicamente um fragmento de tecido aboral de cada embrião. Os embriões pós-cirúrgicos são então autorizados a curar e continuar o desenvolvimento. O DNA de Genomic é extraído do fragmento isolado do tecido e usado como um molde para o PCR locus-específico. O genótipo pode ser determinado com base no tamanho dos produtos de PCR ou presença/ausência de produtos de PCR alelo-específicos. Os embriões pós-cirúrgicos são então ordenados de acordo com o genótipo. A duração de todo o processo de genotipagem depende do número de embriões a serem rastreados, mas requer minimamente 4 – 5 h. Este método pode ser usado para identificar mutantes Knockout de uma população geneticamente heterogênea de embriões e permite análises de fenótipos durante o desenvolvimento.
Introdução
Os cnidarians representam um grupo diverso de animais que incluem Medusa, corais, e Anemones de mar. São diploblastos, compostos por ectoderma e endoderma que são separados por uma matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria é um grupo de irmãs a especiosos Bilateria, a que os modelos animais tradicionais tais como a Drosophila e o Mus pertencem1. Além disso, pensa-se que a divergência Cnidaria-Bilateria ocorreu no período pré-cambriano2. Como tal, estudos comparativos de cnidários e bilaterianos são essenciais para obter insights sobre a biologia de seu ancestral comum mais recente. Recentemente, a genômi....
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Protocolo
1. indução de desova, fertilização in vitro e de-jellying
- Manter Nematostella vectensis em água do mar com uma salinidade de 12 partes por mil (ppt) na escuridão a 16 ° c, alimentando Artemia diariamente.
- No dia antes da indução de desova, coloque os animais em uma incubadora de temperatura e luz controlada. Programe a incubadora para que os animais sejam expostos a 8 h de luz a 25 ° c. Opcional: alimente uma pequena peça (< 1 mm3) de ostra para animais individuais antes de colocá-los na incubadora para melhorar a desova.
- Deixe os animais na incubadora por 1 h a 16 ° c.
- Retire os animais da ....
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Resultados
O genoma de Nematostella tem um único Locus que codifica uma proteína precursora para o neuropeptídeo GLWamide. Três alelos do mutante do Knockout neste Locus (GLW-a, GLW-b, e GLW-c) foram relatados previamente5. Quatro machos heterozygous que carreg um selvagem-tipo alelo (+) e alelo do Knockout GLW-cno locus do glwamide (genótipo: +/GLW-c) foram cruzados com uma fê.......
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Discussão
Descrito aqui um protocolo PCR-baseado para genótipo um único embrião do Anemone de mar sem sacrificar o animal. Depois de desova e de-jellying, os ovos fertilizados são autorizados a desenvolver-se em gastrulae. A região aboral de cada embrião do gástrula é removida cirùrgica, e o tecido aboral isolado é usado para a extração genomic subseqüente do ADN, quando os embriões restantes da borne-cirurgia curarem e continuarem o desenvolvimento. Os extratos de gDNA são usados então para um ensaio do PCR para determinar o genó.......
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Divulgações
O autor não tem nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos revisores anônimos por comentários sobre a versão anterior do manuscrito, que melhorou o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por fundos da Universidade de Arkansas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Incubadora refrigerada Shellab | SRI6PF | Usado para indução de desova | |
| Sal marinho oceânico instantâneo | Oceano instantâneo | 138510 | |
| Cistos de artêmia | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| Cloridrato de L-cisteína | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Agitador orbital padrão, modelo 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALIDADE BIOLÓGICA | 351-007-01 | |
| Cloreto de potássio | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0,5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substituto | US Biológico | N3500 | |
| Solução de proteinase K (20 mg / mL), grau de RNA | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Suporte de agulha de microdissecação | Roboz | RS-6060 | |
| Agulha de dissecação de tungstênio | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion DNA polimerase de alta fidelidade | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide primer direto | 5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3' | ||
| Primário invertido específico para glw-a | 5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3' | ||
| Primer reverso específico para glw-c | 5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3' |
Referências
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al.
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Reimpressões e permissões
