تقييم الاستجابة المناعية الخلوية ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، استخدام "في فيفو البلعمه بالانزيم"

Summary

ويصف هذا البروتوكول مقايسة المجراة في البلعمه في الكبار melanogaster المورفولوجية التحديد الكمي للاعتراف بلعمية وتخليصها من العدوى الميكروبية.

Abstract

ويوفر الحصانة الفطرية في جميع الحيوانات، دفاع فورية وقوية ضد طائفة واسعة من العوامل الممرضة. الاستجابات المناعية خلطيه وخلوية الفروع الرئيسية للحصانة الفطرية، والعديد من العوامل التي تنظم هذه الاستجابات هي تقحم المصانة بين اللافقاريات والثدييات. البلعمه، عنصرا رئيسيا من الحصانة الفطرية الخلوية، قام بها خلايا الدم متخصصة في الجهاز المناعي. ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، برز كنموذج وراثية قوية للتحقيق في الآليات الجزيئية والتأثيرات الفسيولوجية البلعمه في الحيوانات كلها. هنا علينا أن نظهر مقايسة المستندة إلى حقن المجراة في البلعمه قياس امتصاص الجسيمات وتدمير خلايا الدم المورفولوجية ، هيموسيتيس. الإجراء الذي يسمح للباحثين التحكم بدقة في تركيز الجسيمات والجرعة، مما يجعل من الممكن الحصول على نتائج عالية استنساخه في فترة قصيرة من الزمن. التجربة الكمية، من السهل القيام به، ويمكن تطبيقها على الشاشة لعوامل المضيف هذا التأثير الممرض الاعتراف وامتصاص وإزالة الألغام.

Introduction

دفاعات المناعة الفطرية تشكل الخط الأول للدفاع ضد الجراثيم المسببة للأمراض. يمكن تقسيم هذه الردود وظيفيا إلى الحصانة الفطرية خلطيه وخلوية، وكلاهما وساطة من مستقبلات الاعتراف بنمط ترميز الخط (برس) أن الشعور بأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بامبس)¹. هي حفظت العديد من مسارات الإشارات والآليات المستجيب للحصانة الفطرية في الثدييات واللافقريات، مثل ديدان أسطوانية، ايليجانس كاينورهابديتيس، وذبابة الفاكهة، المورفولوجية ميلانوجاستير². ذبابة الفاكهة برز كنظام قوي لدراسة الدفاع المضيف ضد الكائنات الدقيقة المعدية³. المورفولوجية وراثيا أصعب، بسهولة وبتكلفة زهيدة تربيتها في المختبرات، وله وقت قصير جيل. وعلاوة على ذلك، يسلك ذبابة الفاكهة ذات كفاءة عالية الدفاعات ضد مجموعة ميكروبات، مما يتيح النظر في الحصانة المضيف ضد مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية، أو الطفيلية.

تاريخيا استخدمت للذيفان المورفولوجية شاشات الجينية إلى الأمام، على نطاق الجينوم الحمض النووي الريبي بوساطة التدخل ([رني]) فحص خطوط الخلية الحشرات، والقائمة من قبل سلالات ذبابة متحولة دراسة الحصانة الفطرية – مما يؤدي إلى تحديد وتوصيف لعدة مسارات مأمن خلطيه تقحم المصانة^4،5،6،،من⁷⁸. الاستجابة المناعية الفطرية خلطيه، يمكن القول، الأفضل وصف الدفاع المناعي في ذباب الفاكهة. في أعقاب الإصابة، يقود استجابة خلطيه لإنتاج وإطلاق النظمية للميكروبات الببتيد جزيئات (أمبير) في hemolymph، الدم يعادل في الحشرات. الامبير تنتجها حصيلة عالية المصانة و Imd إشارات المسارات. المسار حصيلة مثلى للثدييات TLR/إيل-1R مستقبلات الإشارات، ومسار Imd مثلى لإشارات الثدييات عامل نخر الورم-ألفا. في حصيلة المورفولوجية، مما يشير إلى فعل إيجابية البكتيريا والفطريات فيرو “س المورفولوجية”s^6،،من⁹¹⁰ وإشارات Imd هو الناجم عن بكتيريا سلبية الغرام^{11 ،12}.

الحصانة الخلوية، تتألف من التغليف، وشكل الميلانين والبلعمه من مسببات الأمراض الغازية، التي تقوم بها خلايا الدم متخصصة تسمى هيموسيتيس¹³. وهناك ثلاث فئات من هيموسيتيس في ذبابة الفاكهة: كريستال الخلايا ولاميلوسيتيس وبلاسماتوسيتيس¹³. كريستال الخلايا، التي تشكل 5% هيموسيتيس المتداولة في يرقات، الإفراج عن الإنزيمات بروفينولوكسيداسي (قتراح) مما يؤدي إلى شكل الميلانين المسببة للأمراض والأنسجة المضيف في مواقع الجرح. لاميلوسيتيس، التي لا توجد عادة في أجنة صحية أو يرقات، هي ملتصقة الخلايا التي تغلف الكائنات الخارجية. فعل هذه الخلايا عند بوبارييشن، أو عندما يتم إيداع باراسيتيزينج دبور البيض في اليرقات. بلاسماتوسيتيس متجولة، التي تشكل 95% من تعميم هيموسيتيس في اليرقات وجميع هيموسيتيس المتبقية في البالغين، تلعب دوراً في الأنسجة يعيد البناء خلال التنمية، ولا سيما، بمثابة الخلية الرئيسية المستجيب المورفولوجية الخلوية الحصانة.

البلعمه خط فورية وحاسمة للدفاع المناعة الفطرية؛ الميكروبات التي خرق الحاجز الظهارية المضيفة هي غارقة بسرعة والقضاء على خلايا الدم متجولة (لإجراء استعراض شامل لبيولوجيا الخلايا البلعمه راجع مرجع ¹⁴). تبدأ هذه العملية عند التعرف على نمط germline ترميز مستقبلات (PRRs) على هيموسيتيس الاعتراف بالعوامل الممرضة المرتبطة أنماط الجزيئية (بامبس) للميكروبات. مرة ملتزمة بأهدافها، بدء برس الشلالات مما يشير إلى أن يؤدي إلى تشكيل بسيودوبودس من خلال إعادة عرض cytoskeleton أكتين. بسيودوبودس تحيط الميكروبات، والتي اجتاحت في وقت لاحق واستيعابه في عضية وليدة، يبلوع. وتدمر الميكروبات كما يبلوع يخضع لعملية نضج يبلوع عند يبلوع يتم الاتجار بهن نحو الداخلية من هيموسيتي وأسيديفيس من خلال سلسلة من التفاعلات مع ليسوسوميس. في المختبر والخلية كانت دراسات علم الأحياء في خلايا الثدييات الأولية دور فعال في تحديد ووصف العوامل التي تنظم البلعمه، مثل مستقبلات Fc-غاما الثدييات ومستقبلات C3b^15،16. ومع ذلك، محدودة القدرة على تنفيذ الدراسات المجراة في الشاشات على نطاق واسع أو في نظم الثدييات.

نقدم هنا مقايسة المجراة في البلعمه في ذباب الفاكهة الكبار، الذي يرتكز على إجراء لأول مرة بمختبر ديفيد شنايدر في 2000¹⁷. مختبر شنايدر أظهرت أن phagocytose لاطئة هيموسيتيس متفاوت المسافات على طول السفينة الظهرية البطن سهولة الخرز البوليسترين والبكتيريا. تصور البلعمه، يتم حقن الذباب بالجسيمات المسمى فلوريسسينتلي (مثل كولاي المسمى مع fluorescein isothiocyanate (كولاي-فيتك))، المحتضنة لمدة 30 دقيقة لإتاحة الوقت هيموسيتيس بابتلاع الجزيئات، ومن ثم حقن تريبان الأزرق، الذي يروي fluorescence الجسيمات لا فاجوسيتوسيد أثناء فترة الحضانة. يتم تصوير الأوعية الظهرية يطير ثم استخدام مجهر فلوري مقلوب. استخدام تجربة بسيطة نسبيا، أثبتت أن هيموسيتيس phagocytose البكتيريا ويمكن أن تحول دون مطاط الخرز، أن البلعمه البكتيريا بالحقن قبل الذباب هذه الورقة المنوي، مع الخرز مطاط، وأن الذباب دون الخلوية وخلطيه الاستجابات المناعية عرضه حتى كولاي. ويستند التحليل الوارد في هذا التقرير عمل المختبر شنايدر كمياً المجراة في البلعمه بقياس كثافة الجسيمات التي عصفت بالسفينة الظهرية المرتبطة هيموسيتيس الأسفار.

على غرار النهج المتبع في أنظمة الثدييات، الصفات المورفولوجية المستخدمة في البداية على نطاق الجينوم شاشات [رني] في المختبر لتحديد الجينات المطلوبة للاستجابة المناعية الخلوية^{18،19،20 ،21،،}من²²²³. بيد أن وضع مقايسة البلعمه المجراة في الكبار مكن تجارب متابعة سيضطلع سهولة في الحيوانات كلها، مما يسمح للباحثين للتحقق من البيولوجية دور العوامل التي تم تحديدها في الدراسات في المختبر. وهذا هو الحال مع مستقبلات transmembrane أكلي لحوم البشر، التي حددت لأول مرة كمستقبل بكتيرية في شاشة [رني] استخدام S2 الخلايا²⁴ وثم بعد ذلك سيظهر للتوسط في الإشريكيّة القولونية (كولاي)، البرازية فايكاليس، و المكوّرات العنقودية الذهبية (S. aureus) البلعمه في البالغين²⁵.

لدينا مختبر يعمل الإنزيم البلعمه في المجراة في الشاشات الوراثية إلى الأمام والدراسات على نطاق الجينوم الرابطة (باستخدام لوحة إشارة المورفولوجية الوراثية (دجرب)) لتحديد الجينات الجديدة التي تنظم البلعمه في هيموسيتيس الكبار. أدت هذه الدراسات إلى الوصف مستقبلات بجرب-SC1A وبجرب-سا²⁶، حويصلة داخل الخلايا الاتجار بالبروتين Rab14²⁷غلوتامات الناقل بوليفيموس²⁸، والجيش الملكي النيبالي ملزمة البروتين فوكس-1²⁹.

ونحن نتوقع أن الشاشات المستقبلية تتضمن البلعمه المجراة في يمكن أن يؤدي إلى تحديد الجينات الإضافية التي تعتبر مهمة للاستجابة المناعية الخلوية في المورفولوجية. شاشات باستخدام خطوط فطري متسلسلة تماما، مثل دجرب أو المورفولوجية الاصطناعية السكان الموارد (دسبر)، يمكن تحديد المتغيرات الطبيعية التي تؤثر على التنمية البلعمه أو هيموسيتي. وعلاوة على ذلك، يمكن اعتماد في الأنواع الأخرى من المورفولوجية التقنية أو المستخدمة في الشاشة الجديدة موارد المجتمع، مثل جمع 250 الأنواع المورفولوجية الاحتفاظ بالأنواع المورفولوجية الوطنية مخزون مركز (ندسك ) في كورنيل. هذه التجارب يمكن القيام بها باستخدام المسمى فلوريسسينتلي البكتيرية أو الفطرية الجدار بيوبارتيكليس متوفرة تجارياً أو يمكن أن يؤديها باستخدام أي عدد من الأنواع البكتيرية أو الفطرية – المقدمة أن الميكروب تعرب عن علامات نيون .

Protocol

1. إعداد جسيمات فلوريسسين للحقن إعادة تشكيل 10 مغ بكتيريا المتاحة تجارياً، قتلت الحرارة الجسيمات المسمى مع فلوريسسين (انظر الجدول للمواد) إلى تركز أسهم من 10 ملغ/مل بإضافة PBS العقيمة x 1 ميليلتر 990 و 10 ميليلتر 50 مم أزيد الصوديوم. دوامة المزيج. تقسيم إلى مختبرين ميليلتر 8 تستخد?…

Representative Results

ويبين الشكل 1Aتخطيطي للمقايسة البلعمه المجراة باستخدام الجسيمات المسمى فلوريسسين. هي الذباب الجانب البطني المحملة إلى أسفل على قطعة من الشريط الكهربائية والجزء الأول والثاني من البطن، حيث يقع السفينة الظهرية، مرئية بوضوح (الشكل 1B). المصا…

Discussion

تستخدم الجسيمات المتاحة تجارياً، والمسمى فلوريسسينتلي لتقييم البلعمه في العام (0.2 ميكرون تعديل كاربوكسيلات الجزئي المجالات الخرز الصغير) أو البلعمه للميكروبات (المسمى فلوريسسينتلي الحرارة-أو كيميائيا قتل البكتيريا أو الخميرة). تقييم نضج يبلوع، حدد الباحثون الجسيمات المسمى بصبغة…

Materials

0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)