本方案展示了开颅小鼠创伤性脑损伤模型的建立方法，以及将体外培养的人诱导多能干细胞来源的细胞移植至损伤部位的技术。同时简要描述了对这些操作结果进行的行为学和组织学检测。
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摘要
摘要
创伤性脑损伤（TBI）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。TBI所致的疾病病理过程从最初的机械性损伤逐步发展为继发性损伤，包括细胞凋亡和炎症反应。动物模型在揭示损伤机制和评估潜在神经保护疗法的研究中具有重要价值。本实验方案描述了一种局灶性开放性颅脑创伤的可控皮层冲击（CCI）模型，具体阐述了产生轻度单侧皮层损伤的参数设置。通过双侧感觉运动整合的粘性胶带移除实验，分析CCI后的行为学后果。针对TBI病理的实验性治疗，本方案还展示了一种将培养细胞移植入脑内的操作流程。选用来源于人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的神经细胞培养物，因其在人类TBI患者中可能具有更优的功能恢复潜力。通过改良的DAB免疫组织化学方法，检测hiPSCs在宿主小鼠脑组织中的长期存活情况。
引言
创伤性脑损伤（TBI）是一个泛指术语，用于描述由于头部受到外力冲击引起的间接机械力（如旋转加速度/减速度或对冲伤）或由物体或爆炸冲击波造成的直接损伤所导致的脑部获得性损伤。据估计，TBI 全球范围内约导致9%的死亡病例，每年约有5000万例发生1,2。美国疾病控制与预防中心2017年的一份报告估计，2013年美国因TBI导致的急诊就诊、住院及死亡总数达280万人次3。每年还有大量较轻的TBI未被报告。严重的TBI可导致认知功能、运动功能及整体生活质量的终身损害。近年来，人们才逐渐认识到轻度TBI，尤其是反复发生的运动相关性TBI，具有隐匿性的健康危害4,5。
临床前模型对于获得新的创伤性脑损伤（TBI）机制认识并开发潜在的修复疗法至关重要。TBI的可控皮层冲击（CCI）模型是一种作用于皮层的开颅机械挫伤模型。通过调整冲击参数，可产生从轻度到重度不同程度的CCI损伤6。与其他闭合性颅脑损伤模型不同，CCI损伤属于局灶性损伤而非弥散性损伤。CCI可用于诱导单侧损伤，从而以对侧皮层作为内部对照。本方案描述了针对包含初级躯体感觉和运动区域的部分....
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方案
本方案中描述的所有实验均经统一服务大学动物护理和使用委员会审查并批准。
1. 开颅术与控制性皮质撞击
- 准备可控皮层撞击装置及手术用品。
- 用1 mL无菌生理盐水填充一支带滑动接头的1 mL注射器，用于伤口冲洗。在注射器上安装25 G针头以控制冲洗过程。
- 将环孢素A（CsA）溶于DMSO中，配制成终浓度为1 mg/mL的稀释溶液。用另一支带滑动接头的1 mL注射器吸取0.5 mL环孢素A（CsA）溶液，用于免疫抑制。在CsA注射器上安装25 G或更大规格的针头。
- 将可控皮层撞击活塞连接至立体定位仪的臂上，并调整至15°角。将直径为3 mm的撞击探针连接至活塞上。
- 设定撞击速度为1.5 m/s，撞击停留时间为0.1 s，以产生轻度皮层损伤。
- 进行单侧开颅术
- 将小鼠放入与异氟烷蒸发器相连的麻醉诱导舱中，氧气流速约为0.7 L/min，使用约3%异氟烷诱导麻醉。通过脚趾夹捏无反应来判断麻醉深度。
- 使用电动剪刀剃除头皮毛发，并用棉签清除松散的毛发。
- 将小鼠固定于配备麻醉面罩的立体定位仪中。
- 在立体定位仪上放置设定为37 °C的加热垫，置于小鼠身下以维持麻醉期间的体温。使用耳杆和门齿固定器固定头部，调整头部位置使....
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结果
颅骨切除术有助于实验性脑损伤和治疗性细胞移植：脑损伤的控制性皮质冲击模型及后续的细胞移植治疗需要仔细去除覆盖的颅骨。可在颅骨的任何背侧表面进行颅骨切除术，以便对目标脑区进行操作。图1 展示了直径为5 mm的颅骨切除示意图，用于暴露初级躯体感觉皮层和运动皮层（图1A）。在颅骨切除术后24小时，进行第二次手术，将人诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经细胞悬液注射至皮层深层（图1B）。颅骨切除术后第一天出现一定程度的脑水肿属于正常现象，尤其是在实施控制性皮质冲击（CCI）后。然而，在该操作的各个阶段保护脑血管对于皮层存活至关重要。图2 展示了一只小鼠的细胞移植过程，其脑组织仅有轻微脑疝、出血极少且皮层血管化广泛。这些特征是手术成功的重要预后指标。
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讨论
轻度 CCI 作为测试实验性再生疗法的模型系统
CCI 模型是研究皮层机械性损伤后组织功能障碍机制的有力工具。该模型的一个显著优势在于其损伤参数具有可调节性。研究者可通过调整撞击的 Z 轴深度、速度或停留时间，按需增加或减轻损伤程度10,25。当操作正确时，轻度 CCI 脑挫伤模型应仅引起轻度的皮层细胞死亡和极少的空洞形成。开颅及骨瓣移除操作必须极为谨慎。钻取开颅沟槽时施加过大的向下压力，可能因产热和振动导致皮层损伤。在移除颅骨瓣过程中对硬脑膜的机械性破坏，几乎总是预示着严重的皮层损伤。主要皮层血管的破坏很可能导致皮层过度损伤，此类动物应予以排除出实验。遗憾的是，术后当天损伤加重的迹象可能较为隐匿。水肿或小皮层血管破裂并不一定代表不良预后。由缺血引起的血肿和异常着色则是更明确的手术并发症指征。详细记录术中事件，并将并发症与组织病理学结果相关联，对于优化开颅技术至关重要。
必须指出，动物的轻度创伤性脑损伤（mTBI）建模存.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由神经科学与再生医学中心（CNRM，资助号 G170244014）的资助支持。我们感谢Mahima Dewan和Clara Selbrede在黏合剂去除预实验研究中的协助。Kryslaine Radomski完成了初步的脑损伤和细胞移植手术。美国陆军医学大学（USU）CNRM临床前研究核心实验室的Amanda Fu和Laura Tucker分别在动物手术和行为学测试方面提供了宝贵的建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 毫升注射器 | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 毫升翻盖式试管 | Denville | C2170 | |
| 10 微升注射器 | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide 注射针头 | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% 乙醇 | 可选产品；因地区而异 | ||
| 对乙酰氨基酚口服混悬液 | Tylenol (儿童用) | 用水稀释至 1 mg/ml | |
| 麻醉气体蒸发器 | Vetland | 521-11-22 | |
| 动物操作布 | 从百货商店购买 | ||
| 聚维酮碘（Betadine） | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| 压缩氧气 | 可选产品；因地区而异 | ||
| 环孢素 A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB 染色试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| 驴抗小鼠 IgG 抗体，HRP 标记 | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| 电工胶带 | 3M Corporation | 从百货商店购买 | |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 玻璃毛细移液管，外径 1 mm，内径 0.58 mm | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| 高速旋转微型电机套件 | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| 理想微型钻头套装（5 件装） | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One CCI 立体定位撞击器 | Leica Biosystems | 39463920 | |
| 异氟烷 | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| 实验台计时器 | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| 微量移液器拉制仪 | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | 任意型号均可 |
| 显微镜盖玻片 | Fisherbrand | 12-545-E | |
| 显微镜载玻片封片介质 | 可选产品 | ||
| 镜子 | 从百货商店购买 | ||
| 小鼠抗人核抗原抗体 | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse 封闭试剂盒 | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| 持针器止血钳 | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| 眼科软膏 | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| 眼科弹簧剪 | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| 塑料盒 | 从百货商店购买 | ||
| 塑料圆筒 | 从百货商店购买 | ||
| QSI 电动注射泵 | Stoelting | 53311 | |
| 可拆卸针头压缩接头 | Hamilton | 55750-01 | |
| 小型啮齿类动物立体定位仪 | Stoelting | 51925 | |
| 小型剪刀 | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| 无菌酒精棉片 | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| 无菌棉签/Kendall 棉签 | Tyco Healthcare | 540500 | |
| 无菌生理盐水 | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| 秒表（2 个） | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold 显微镜载玻片 | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| 缝合线 — 5.0 丝线带弯针 | Oasis | MV-682 |
参考文献
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al.
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重印与许可
