قياس المعدلات المحتملة للحد من نترات الدسيميلي إلى الأمونيوم على أساس 14NH4+/15NH4+ تحليلات عن طريق التحويل المتسلسل إلى N2O
Summary
وتقدم بالتفصيل سلسلة من الطرق لتحديد معدل DNRA المحتملة على أساس 14NH4+/15NH4+ التحليلات. NH4+ يتم تحويلها إلى N2O عبر عدة خطوات وتحليلها باستخدام الكروماتوغرافيا الغاز رباعية الروبول- قياس الطيف الشامل.
Abstract
11 – وقد أخذت أهمية فهم مصير النترات (NO3)،−وهي الأنواع N المهيمنة التي يتم نقلها من النظم الإيكولوجية الأرضية إلى النظم الإيكولوجية المائية، في التزايد لأن الأحمال العالمية من النيتروجين قد زادت بشكل كبير بعد التصنيع. إن الحد من النترات الدسيميلية إلى الأمونيوم (DNRA) و التخريب هما عمليتان ميكروبيتان تستخدمان NO3– للتنفس. ومقارنة بالحرمان من التسهّم، لم يتم تحديد كمي لنشاط الـ DNRA إلا بقدر محدود. وقد أدى ذلك إلى عدم كفاية فهم أهمية DNRA في التحولات رقم3والعوامل المنظمة لهذه العملية. والهدف من هذه الورقة هو توفير إجراء مفصل لقياس معدل DNRA المحتمل في العينات البيئية. وباختصار، يمكن حساب معدل DNRA المحتملة من 15N المسمى الأمونيوم(15NH4+) معدل تراكم في 15NO3– إضافة حضانة. 2 – يتألف تحديد التركيزات 14NH4+ و15NH4+ التركيزات الموصوفة في هذه الورقة من الخطوات التالية. أولاً، يتم استخراج NH4+ في العينة ومحاصرة على مرشح زجاجي حموضة كملح الأمونيوم. ثانياً، يتم اجساق الأمونيوم المحاصر ويتأكسد إلى NO3– عبر أكسدة persulfate. ثالثاً، يتم تحويل NO3– إلى N2O عبر denitrifier N2O. وأخيرا، يتم تحليل N2O المحولة باستخدام نظام كروماتوغرافيا الطيفي -الكتلة الغازية التي تم تطويرها سابقا. وقد طبقنا هذه الطريقة على رواسب الأهوار المالحة وحسبنا معدلاتها المحتملة للـ DNRA، مما يدل على أن الإجراءات المقترحة تسمح بتحديد بسيط وأكثر سرعة مقارنة بالطرق الموصوفة من قبل.
Introduction
وقد أدى التركيب الاصطناعي للأسمدة النيتروجينية وتطبيقه على نطاق واسع إلى إزعاج دورة النيتروجين العالمية إلى حد كبير. ويقدر أن نقل النيتروجين التفاعلي من النظم الأرضية إلى النظم الساحلية قد تضاعف منذ زمن ما قبل الثورة الصناعية1. ويُجرَّف جزء كبير من الأسمدة التي تُطبق على حقل معين من التربة إلى الأنهار أو المياه الجوفية، في المقام الأول باعتبارها لا3– 2. وهذا قد يسبب مشاكل بيئية مثل تلوث مياه الشرب، ومغذيات، وتشكيل نقص الأكسجة. NO3– في بيئات المياه يتم إزالتها من أو الاحتفاظ بها في النظام الإيكولوجي عن طريق الاستيعاب البيولوجي ومختلف العمليات الجرثومية. ومن المعروف أن الحرمان من التخريب و anammox هي عمليات إزالة الميكروبات الرئيسية ل NO3−. التكريب هو التخفيض الميكروبي لـ NO3– إلى المنتجات الغازية N (NO و N2O و N2) إلى جانب أكسدة مانح إلكترون، مثل المواد العضوية، مما يقلل من خطر المشاكل المذكورة أعلاه. Anammox تنتج أيضا N2 من NO2– وNH4+; لذلك، فإنه يزيل N غير العضوية من النظام الإيكولوجي. وعلى العكس من ذلك، تعمل الهيئة على الاحتفاظ بـ N في نظام إيكولوجي؛ ومن المسلم به عموما أن يتم تنفيذ DNRA في المقام الأول عن طريق البكتيريا التخمير أو البكتيريا chemolithoautotrophic وأنها تقلل من dissimilatory NO3– إلى التوافر الحيوي وأقل متنقلة NH4+.
وقد أجريت دراسات عن الأراضي المُصابة بالانساب في المقام الأول في النظم الإيكولوجية البحرية أو النظم الإيكولوجية لمصبات الأنهار، مثل رواسب المحيطات أو مصبات الأنهار والمياه، والملح أو تربة الأهوار الملوحة، وتربة المنغروف. النظم الإيكولوجية الساحلية أو البحرية مهمة كخزانات لإزالة NO3– من النظم الإيكولوجية الأرضية، وفي الدراسات السابقة فقد تبين أن DNRA تساهم على مدى مجموعة واسعة جدا من NO3– إزالة (0-99)3،4،5،6،7،8،10،,11،1210،,13،14،15،,16،18.18 وعلاوة على ذلك، وقد ثبت وجود DNRA في مجموعة واسعة من البيئات بما في ذلك بيئات المياه العذبة19، الأرز التربة20، والتربة الغابات21. في حين أظهرت هذه الدراسات أن DNRA يمكن أن تكون قابلة للمقارنة ل denitrification NO3– إزالة، والدراسات التي تقيس نشاط DNRA لا تزال محدودة جدا بالمقارنة مع تلك التي قياس الحرمان.
وقد تم تقييم معدل DNRA باستخدام 15تقنية وضع العلامات النية بالاقتران مع تحليل البيانات عن طريق النماذج التحليلية أو الرقمية. ويستند أحد الحلول التحليلية لحساب معدل DNRA على الزيادة في التخصيب 15N من N4+ تجمع بعد إضافة 15NO3– كمتتبع. 15 N-المسمى NO3– يضاف إلى عينة ومحتضنة، ويمكن بعد ذلك حساب معدل DNRA من التغيرات في نسبة التركيز والنظائر في NH4+ قبل وبعد فترة معينة من الزمن. وفي هذه الورقة، يرد وصف تفصيلي لطريقة لقياس درجة التركيز من NH4+ ونسبة النظائر، المطلوبة لحساب معدل DNRA. أساسا، الأسلوب المبلغ عنه هنا هو مزيج من عدة تقنيات ذكرت سابقا22،23،24،25،26 مع التعديلات المضافة إلى بعض الإجراءات. وتتألف هذه الطريقة من سلسلة من خمسة إجراءات المكون: (1) حضانة عينة بيئية مع تعديل جهاز تتبع النظائر المستقرة، 15NO3-،(2) استخراج واسترداد NH4+ باستخدام “إجراء نشر” مع تعديلات، (3) أكسدة persulfate من NH4+ في العينة، تتكون من السكان الأصليين NH4+ و 15NH4+ مشتقة من 15NO3– عن طريق نشاط DNRA ، إلى NO3– و 15NO3–، (4) التحول الميكروبي اللاحق NO3– و 15NO3– إلى N2O isotopomers عن طريق طريقة denitrifier المعدلة، و (5) القياس الكمي للISOTOPOMers N2O باستخدام الكروماتوغرافيا الغازية -قياس الطيف الشامل (GC/MS). في القسم التالي، أولاً، يتم وصف الإعداد للإجراءات (2) و (4) ثم، بعد ذلك، يتم وصف جميع الإجراءات المكونة الخمسة بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تحديد نسبة تركيز ونظائر NH4+ لتحليل DNRA كمياً باستخدام عدة طرق. وتقاس عموماً بشكل منفصل تركيزات ونسب النظائر من NH4++ بشكل منفصل. يتم عادة قياسالتركيز NH+ 4باستخدام أساليب قياس الألوان بما في ذلك autoanalyzer4،10،<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ناوتو تاناكا على المساعدة في جمع البيانات وتطوير البروتوكول. تم دعم جمع العينات من قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 17K15286.
Materials
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
References
- Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
- Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
- Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P., Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. 117, 133-141 (1996).
- Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
- Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
- An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
- Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
- Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
- Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
- Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
- Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
- Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
- Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
- Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
- Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
- Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
- Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
- Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
- Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
- Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
- Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
- Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
- Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
- Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
- Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
- Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
- Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
- Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
- Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
- Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
- Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
- Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
- Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
- Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
- Tiedje, J. M., Zehnder, A. J. B. . Biology of Anaerobic Microorganisms. , 179-244 (1988).
- Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
- Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
- Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
- Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
- Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).
