Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner
Summary
Sumo er et vigtigt og meget bevaret, lille ubiquitin-lignende ændrings-protein. I denne protokol beskriver vi brugen af et stress-tolerant rekombinant SUMO-diffuse Rings protein (kmUTAG) til at visualisere indfødte, ukodede SUMO-konjugater og deres lokalisering i en række forskellige celletyper.
Abstract
Her præsenterer vi en ny metode til at studere sumoylering af proteiner og deres sub-cellulære lokalisering i pattedyrceller og fyrretræsnematoden oocytter. Denne metode udnytter et rekombinant modificeret SUMO-diffuse Rings protein fragment, kmUTAG, afledt af Ulp1 SUMO proteasehæmmere af den stress-tolerante spirende gær Kluyveromyces marxianus. Vi har tilpasset egenskaberne for kmUTAG med det formål at studere sumoylering i en række modelsystemer uden brug af antistoffer. Til studiet af SUMO, KmUTAG har flere fordele i forhold til antistof-baserede tilgange. Dette stress-tolerante SUMO-diffuse Rings reagens fremstilles i kombination, det genkender indfødte SUMO-isoformer fra mange arter, og i modsætning til kommercielt tilgængelige antistoffer viser det reduceret affinitet til fri, ukonjugeret SUMO. De repræsentative resultater, der er vist her, omfatter lokalisering af SUMO-konjugater i pattedyrs vævskultur celler og fyrretræsnematoden oocytter.
Introduction
Formålet med denne metode er at gøre det lettere at studere og analysere SUMO-konjugeret proteiner ved hjælp af det rekombinante SUMO-opfangnings UTAG-protein (Ulp Domain Tag). Som beskrevet nedenfor kan UTAG bruges i stedet for andre reagenser og tilgange til at rense, opdage og visualisere SUMO-modificerede proteiner. Afhængigt af vækstbetingelserne kan cellerne indeholde hundreder eller tusinder af proteiner, der er modificeret med SUMO-eller SUMO-kæder (til gennemsyn, se Kerscher et al. 20061 og kerscher 20162). Dette udgør et betydeligt problem for de funktionelle analyser af specifikke SUMO-modificerede proteiner, især da kun en brøkdel af et bestemt sumoyleringsmål faktisk er ændret3. Ud over deres roller i væsentlige cellulære processer såsom transkriptional regulering, protein homøostase, respons på cellulære stress, og kromatin remodeling under mitose og meiose; Det er nu blevet tilstrækkeligt klart, at Sumo, Sumo-modificerede proteiner, og Sumo pathway komponenter også har potentiale som biomarkører for patologier såsom kræft og neurodegenerative sygdomme4,5,6 ,7. Dette understreger behovet for robuste, pålidelige og let tilgængelige værktøjer og innovative tilgange til påvisning og funktionel analyse af SUMO-modificerede proteiner i en række forskellige celler og prøver.
I mange systemer er Sumo-specifikke antistoffer reagenserne i valg til påvisning, isolering og funktionelle analyser af Sumo-modificerede proteiner8,9. Men nogle kommercielt tilgængelige SUMO-specifikke antistoffer er dyre, begrænset i mængde eller tilgængelighed, tilbøjelige til at udstille vildt variable tilhørsforhold og Cross-reaktivitet, og i nogle tilfælde mangler reproducerbarhed10. En alternativ tilgang er udtrykket af epitop-tagget Sumo i transformerede celler og organismer, men sammenkædning af epitop Tags med Sumo kan kunstigt sænke dets konjugering til protein målene11. Desuden er epitoper ikke nyttige, når utransformerede celler eller væv evalueres.
Ulp1 er en bevaret SUMO-proteasehæmmere fra S. cerevisiae , som begge forarbejder Sumo-prækursor og desumoylates Sumo-konjugeret protein12. Vi udviklede utag-reagensen baseret på den serendipitøse observation, at en mutation af den katalytiske cystein (C580S) i Ulp1’s Sumo-behandling Ulp domæne (ud) ikke kun forhindrer Sumo spaltning, men også fælder Sumo-konjugeret proteiner med høj aviditet12. For nemheds skyld, vi henviste til denne carboxy-Terminal SUMO-diffusering Ulp1 (C580S) fragment som UTAG (kort for UD TAG). UTAG er et rekombinant pan-SUMO-fælde fangstprotein, der repræsenterer et nyttigt alternativ til anti-SUMO-antistoffer, der anvendes til isolering og påvisning af SUMO-modificerede proteiner. Vigtigere, det specifikt genkender indbygget foldet, konjugeret SUMO og ikke blot en eller flere epitoper på SUMO. For at forbedre både protein stabiliteten og den SUMO bindende styrke UTAG genererede vi en variant af UTAG fra den stress-tolerante gær Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG binder SUMO-conjugates stramt med nanomolær affinitet13. Derudover er kmUTAG modstandsdygtig over for forhøjede temperaturer (42 °C), reduktionsmidler (5 mM TCEP-tris (2-carboxyethyl) phosphinhydrochlorid), denatureringsmidler (op til 2 M urea), oxiderende midler (0,6% hydrogenperoxid) og ikke-ioniske rengøringsmidler. Denne stress tolerance er gavnlig under barske rensnings forhold og langvarig inkubationstid, hvilket sikrer dens stabilitet og SUMO-fælde fangstaktivitet. Det er dog ikke overraskende, at Kmutag’s SUMO-fælde fangstaktivitet er uforenelig med cystein-modificerende reagenser, ionholdige rengøringsmidler og fuldt denaturerede protein ekstrakter. Kmutags bemærkelsesværdige affinitet og egenskaber indikerer, at dette reagens kan blive en del af standardrepertoiret til studiet af sumoylerede proteiner i flere arter.
Her giver vi en enkel metode til påvisning af SUMO-modificerede proteiner i pattedyrsceller og nematoder ved hjælp af et rekombinant fluorescerende mCherry-KmUTAG-fusionsprotein (kmUTAG-FL).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her introducerer vi brugen af kmUTAG-fl, et rekombinant protein, til funktionelle undersøgelser af SUMO i faste pattedyrceller og dissekterede fyrretræsnematoden gonader. KmUTAG-fl er et stress-tolerant pan-SUMO-specifikt reagens, der genkender og fælder indfødte SUMO-konjugeret proteiner og SUMO-kæder. Da suis tertiære struktur er meget bevaret, er det meget sandsynligt, at SUMO-varianter fra yderligere model-og ikke-modelsystemer kan analyseres med kmUTAG-fl-reagensen. KmUTAG-fl kan som sådan repræsentere et ny…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke alle medlemmer af Kerscher Lab for deres støtte, Nathalie Nguyen for kritisk læsning af manuskriptet, og Lidia EPP for sekventering. Dette arbejde er blevet støttet af Commonwealth Research kommercialisering fond MF16-034-LS til OK. Forskningsstøtte til W & M studerende blev leveret af Bailey-Huston Research fond, og Charles Center Honors stipendier til RY og CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. . SUMOylation. , 1-11 (2016).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2′-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
