सुमो का स्थानीयकरण-संशोधित फ्लोरोसेंट सूमो-फँसाने प्रोटीन का उपयोग कर प्रोटीन
Summary
सूमो एक आवश्यक और अत्यधिक संरक्षित, छोटे ubiquitin की तरह संशोधक प्रोटीन है । इस प्रोटोकॉल में हम एक तनाव-सहिष्णु पुनः संयोजक सूमो-फंसाने प्रोटीन के उपयोग का वर्णन कर रहे है (kmUTAG) के लिए देशी, untagged सूमो conjugates और सेल प्रकार की एक किस्म में उनके स्थानीयकरण कल्पना ।
Abstract
यहाँ हम स्तनधारी कोशिकाओं और सूत्रकृमि ओयोसाइट्स में प्रोटीन के sumoylation और उनके उप सेलुलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत कर रहे हैं । इस विधि एक पुनः संयोजक संशोधित सूमो-फंसाने प्रोटीन टुकड़ा, kmutag, तनाव सहिष्णु उभरते खमीर kluyveromyces marxianusके Ulp1 SUMO प्रोटीज से व्युत्पंन का उपयोग करता है । हम एंटीबॉडी के उपयोग के बिना मॉडल सिस्टम की एक किस्म में sumoylation अध्ययन के उद्देश्य के लिए kmUTAG के गुणों को अनुकूलित किया है । सुमो के अध्ययन के लिए, KmUTAG कई लाभ जब एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोण की तुलना में है । यह तनाव सहिष्णु सूमो-ट्रैपिंग अभिकर्मक पुनः संयोजक उत्पादन किया जाता है, यह कई प्रजातियों से देशी सूमो isoforms पहचानता है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के विपरीत यह मुक्त, असंसंयुग्मित सूमो के लिए कम आत्मीयता से पता चलता है । प्रतिनिधि परिणाम यहां दिखाया गया है स्तनधारी ऊतक संस्कृति कोशिकाओं और सूत्रकृमि oocytes में सूमो conjugates का स्थानीयकरण शामिल हैं ।
Introduction
इस विधि का उद्देश्य रीकॉम्पानेंट सूमो-ट्रैपिंग यूटैग (ULp डोमेन टैग) प्रोटीन का उपयोग करके सूमो-संयुग्मित प्रोटीनों के अध्ययन और विश्लेषण को सुगम बनाना है । के रूप में नीचे विस्तृत, UTAG अंय अभिकर्मक और दृष्टिकोण के एवज में इस्तेमाल किया जा सकता को शुद्ध, पता लगाने, और सूमो-संशोधित प्रोटीन कल्पना । वृद्धि की स्थिति के आधार पर, कोशिकाओं सैकड़ों या हजारों प्रोटीन है कि सूमो या सूमो जंजीरों के साथ संशोधित कर रहे हैं (समीक्षा के लिए देख Kerscher एट अल. २००६1 और kerscher २०१६2) शामिल हो सकते हैं । यह विशिष्ट सूमो के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक काफी कठिनाई का प्रतिनिधित्व करता है-संशोधित प्रोटीन, विशेष रूप से केवल एक विशेष sumoylation लक्ष्य का एक अंश वास्तव में3संशोधित किया गया है । आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं में अपनी भूमिकाओं के अलावा, जैसे कि ट्रांसक्रिप्शनल नियमन, प्रोटीन homeostasis, सेलुलर तनाव के लिए प्रतिक्रिया, और मिटोसिस और अर्धसूत्रण के दौरान क्रोमेटिन remodeling; अब यह पर्याप्त रूप से स्पष्ट हो गया है कि सूमो, सूमो-संशोधित प्रोटीनों और सूमो पाथवे के घटकों में भी कैंसर और न्यूरोडिजेनेरेटिव विकारों के रूप में विकृतियों के लिए biomarkers के रूप में क्षमता4,5,6 ,7. यह विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और नमूनों में सुमो-मोडीफाइड प्रोटीनों की पहचान और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए मजबूत, विश्वसनीय, और आसानी से उपलब्ध उपकरणों और नवीन दृष्टिकोणों की आवश्यकता को रेखांकित करता है ।
कई प्रणालियों में, सूमो-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने, अलगाव और सूमो-संशोधित प्रोटीन8,9के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पसंद के अभिकर्मक हैं । हालांकि, कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूमो-विशिष्ट एंटीबॉडी महंगे हैं, मात्रा या उपलब्धता में सीमित, बेतहाशा परिवर्तनशील बंधुता और पार-reactivity प्रदर्शन करने के लिए प्रवण, और कुछ उदाहरणों में reproducibility की कमी10. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण epitope की अभिव्यक्ति-बदल कोशिकाओं और जीवों में सूमो टैग की गई है, लेकिन epitope टैग सूमो को जोड़ने कृत्रिम रूप से प्रोटीन लक्ष्य11के लिए अपनी संयुग्मन कम हो सकता है । इसके अतिरिक्त, epitopes उपयोगी नहीं है जब untransformed कोशिकाओं या ऊतकों का मूल्यांकन कर रहे हैं ।
Ulp1 एस सेरेविसिए से एक संरक्षित सूमो प्रोटीज है कि दोनों सूमो अग्रदूत और desumoylates सूमो-संयुग्मित प्रोटीन12प्रक्रियाओं । हम का विकास UTAG अभिकर्मक serendipitous अवलोकन पर आधारित है कि उत्प्रेरक Cysteine के एक उत्परिवर्तन (C580S) में Ulp1’s सूमो प्रसंस्करण यूएलपी डीomain (यूडी) न केवल सूमो दरार से बचाता है, लेकिन यह भी जाल सूमो-संयुग्मित प्रोटीन के साथ उच्च उत्सुकता12। सरलता के लिए, हमने इस कार्बोक्सी-टर्मिनल सूमो-ट्रैपिंग Ulp1 (C580S) खंड को यूटैग (यूडी टैग के लिए शॉर्ट) के रूप में संदर्भित किया है । Utag एक पुनः संयोजक पैन-सूमो फंसाने प्रोटीन है कि विरोधी के लिए एक उपयोगी विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है सूमो-आइसोलेशन और सूमो संशोधित प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी । महत्वपूर्ण बात, यह विशेष रूप से पहचानता-तह, संयुग्मित सूमो और सूमो पर न सिर्फ एक या कई epitopes । UTAG के प्रोटीन स्थिरता और सूमो बाध्यकारी शक्ति दोनों में सुधार करने के लिए, हम तनाव सहिष्णु खमीर Kluyveromyces marxianus (किमी) से utag के एक संस्करण उत्पंन । के————–———- इसके अतिरिक्त, kmUTAG ऊंचा तापमान (४२ डिग्री सेल्सियस) के लिए प्रतिरोधी है, एजेंटों (5 मिमी TCEP-Tris (2-carboxyethyl) फॉसफिन हाइड्रोक्लोराइड), denaturants (अप करने के लिए 2 एम यूरिया), ऑक्सीकरण एजेंटों (०.६% हाइड्रोजन पेरोक्साइड), और गैर-आयनिक डिटर्जेंट । यह तनाव सहिष्णुता कठोर शुद्धि हालत और लंबे समय तक ऊष्मायन समय, अपनी स्थिरता और सूमो-फंसाने गतिविधि को सुनिश्चित करने के दौरान फायदेमंद है । आश्चर्य की बात नहीं है, तथापि, है KmUTAG सूमो-फंसाने गतिविधि cysteine-संशोधित अभिकर्मकों, ईओण डिटर्जेंट और पूरी तरह से विकृत प्रोटीन के अर्क के साथ असंगत है । उल्लेखनीय समानता और KmUTAG के गुण संकेत मिलता है कि इस अभिकर्मक कई प्रजातियों में sumoylated प्रोटीन के अध्ययन के लिए मानक प्रदर्शनों की सूची का हिस्सा बन सकता है ।
यहां हम एक पुनः संयोजक फ्लोरोसेंट mCherry-के———————————————————
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम निश्चित स्तनधारी कोशिकाओं में सूमो के कार्यात्मक अध्ययन और विच्छेदक सूत्रकृमि gonads के लिए kmUTAG-fl, एक पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग करें परिचय । KmUTAG-fl एक तनाव सहिष्णु पैन-सूमो विशिष्ट अभिकर्मक है कि पह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके समर्थन के लिए Kerscher लैब के सभी सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, के लिए महत्वपूर्ण पांडुलिपि के पढ़ने Nathalie गुयेन, और अनुक्रमण के लिए Lidia Epp । यह काम राष्ट्रमंडल अनुसंधान के व्यावसायीकरण कोष MF16-034-LS को ठीक करने के लिए समर्थन किया गया है । डब्ल्यू & एम के छात्रों के लिए अनुसंधान सहायता बेली द्वारा प्रदान की गई थी ह्यूस्टन रिसर्च फंड, और चार्ल्स केंद्र संमान फैलोशिप के लिए RY और CH ।
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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