Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner
Summary
SUMO er et essensielt og svært bevart, lite, ubiquitin-lignende endrings protein. I denne protokollen beskriver vi bruken av en stress-tolerant rekombinant SUMO-fangst protein (kmUTAG) å visualisere native, umerkede SUMO konjugater og deres lokalisering i en rekke celletyper.
Abstract
Her presenterer vi en ny metode for å studere sumoylation av proteiner og deres sub-cellulære lokalisering i pattedyrceller og nematode oocytter. Denne metoden utnytter en rekombinant modifisert SUMO-fangst protein fragment, kmUTAG, avledet fra Ulp1 SUMO protease av stress-tolerant spirende gjær Kluyveromyces marxianus. Vi har tilpasset egenskapene til kmUTAG med det formål å studere sumoylation i en rekke modellsystemer uten bruk av antistoffer. For studiet av SUMO, KmUTAG har flere fordeler sammenlignet med antistoff-baserte tilnærminger. Dette stress-tolerant SUMO-fangst reagens er produsert recombinantly, gjenkjenner den innfødte SUMO isoformene fra mange arter, og i motsetning til kommersielt tilgjengelige antistoffer det viser redusert affinitet for gratis, unconjugated SUMO. Representative resultater som vises her inkluderer lokalisering av SUMO konjugater i pattedyr vev kultur celler og nematode oocytter.
Introduction
Formålet med denne metoden er å lette studiet og analyse av SUMO-bøyd proteiner ved hjelp av rekombinant SUMO-fangst UTAG (ULP Domain tag) protein. Som beskrevet nedenfor, kan UTAG brukes i stedet for andre reagenser og tilnærminger for å rense, oppdage og visualisere SUMO-modifiserte proteiner. Avhengig av vekstforhold, kan cellene inneholde hundrevis eller tusenvis av proteiner som er modifisert med SUMO eller SUMO kjeder (for gjennomgang se Kerscher et al. 20061 og Kerscher 20162). Dette representerer en betydelig vanskelighetsgrad for de funksjonelle analysene av spesifikke SUMO-modifiserte proteiner, spesielt siden bare en brøkdel av et bestemt sumoylation mål faktisk er modifisert3. I tillegg til sine roller i essensielle cellulære prosesser som transcriptional regulering, protein homeostase, responsen på mobilnettet stress, og kromatin remodeling under mitose og meiose; Det har nå blitt tilstrekkelig klart at Sumo, Sumo-modifiserte proteiner, og Sumo Pathway komponenter har også potensial som biomarkører for sykdommer som kreft og nevrodegenerative lidelser4,5,6 ,7. Dette understreker behovet for robuste, pålitelige og lett tilgjengelige verktøy og innovative tilnærminger for påvisning og funksjonell analyse av SUMO-modifiserte proteiner i en rekke celler og prøver.
I mange systemer, Sumo-spesifikke antistoffer er reagensene av valget for deteksjon, isolering og funksjonelle analyser av Sumo-modifiserte proteiner8,9. Men noen kommersielt tilgjengelige SUMO-spesifikke antistoffer er kostbare, begrenset i kvantitet eller tilgjengelighet, utsatt for å vise vilt variable slektskap og kryss-reaktivitet, og i noen tilfeller mangler reproduserbarhet10. En alternativ tilnærming er uttrykk for epitope SUMO i forvandlet celler og organismer, men linking epitope koder til SUMO kan kunstig senke Bøyning til protein mål11. I tillegg er epitopes ikke nyttig når transformert celler eller vev evalueres.
Ulp1 er en bevart SUMO protease fra S. cerevisiae at begge prosessene i Sumo forløper og desumoylates Sumo-bøyd proteiner12. Vi utviklet UTAG reagens basert på serendipitous observasjon at en mutasjon av katalysatoren cystein (C580S) i Ulp1’s SUMO prosessering ULP domene (UD) ikke bare hindrer Sumo KLØFT men også feller Sumo-bøyd proteiner med høy avidity12. For enkelhet, refererte vi til dette carboxy-Terminal SUMO-fangst Ulp1 (C580S) fragment som UTAG (forkortelse for UD TAG). UTAG er et rekombinant Pan-SUMO-fangst protein som representerer et nyttig alternativ til anti-SUMO-antistoffer som brukes til isolering og påvisning av SUMO-modifiserte proteiner. Viktigere, det spesielt anerkjenner innfødt-foldet, bøyd SUMO og ikke bare en eller flere epitopes på SUMO. For å forbedre både protein stabiliteten og SUMO bindende styrke UTAG, genererte vi en variant av UTAG fra stress-tolerant gjær Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG tett binder SUMO-konjugater med nanomolar affinitet13. I tillegg er kmUTAG motstandsdyktig mot forhøyede temperaturer (42 ° c), reduksjonsmidler (5 mM TCEP-Tris (2-carboxyethyl) fosfin hydrochloride), denaturants (opp til 2 M urea), oksiderende midler (0,6% hydrogen peroxide), og ikke-ioniske vaskemidler. Dette stress toleranse er gunstig under harde rensing tilstand og langvarig inkubasjons ganger, sikre sin stabilitet og SUMO-fangst aktivitet. Ikke overraskende, imidlertid, KmUTAG ‘ SUMO-fange aktivitet er inkompitabel med cystein-endring reagenser, ioniske rengjøringsmidler og fullt ut denaturert protein ekstrakter. Den bemerkelsesverdige affinitet og egenskapene til KmUTAG tyder på at denne reagens kan bli en del av standard repertoaret for studiet av sumoylated proteiner i flere arter.
Her gir vi en enkel metode for å oppdage SUMO-modifiserte proteiner i pattedyrceller og nematoder ved hjelp av et rekombinant fluorescerende mCherry-KmUTAG Fusion protein (kmUTAG-fl).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her introduserer vi bruken av kmUTAG-FL, et rekombinant protein, for funksjonelle studier av SUMO i faste pattedyrceller og dissekert nematode gonader. KmUTAG-fl er en stress-tolerant Pan-SUMO spesifikk reagens som anerkjenner og feller innfødte SUMO-bøyd proteiner og SUMO kjeder. Siden SUMO ‘ s tertiær struktur er svært bevart er det svært sannsynlig at SUMO varianter fra ekstra modell og ikke-modellsystemer kan analyseres med kmUTAG-fl reagens. Som sådan kan KmUTAG-fl representere et nyttig alternativ eller sekun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke alle medlemmer av Kerscher-laboratoriet for deres støtte, Nathalie Nguyen for kritisk lesning av manuskriptet, og Lidia EPP for sekvenser. Dette arbeidet har blitt støttet av Commonwealth Research kommersialisering fondet MF16-034-LS til OK. Forskning støtte for W & M studentene ble levert av Bailey-Huston Research Fund, og Charles Center Honors stipend til RY og CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. . SUMOylation. , 1-11 (2016).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2′-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
