Оценка терапевтического ангиогенеза в модели Murine Hindlimb Ischemia
Summary
Здесь представлена критическая экспериментальная модель ишемии задних конечностей, за которой следует батарея функциональных, гистологических и молекулярных тестов для оценки эффективности ангиогенной терапии.
Abstract
Критическая ишемия конечностей (CLI) является серьезным заболеванием, которое влечет за собой высокий риск ампутации нижних конечностей. Несмотря на реваскуляризацию, являясь золотым стандартом терапии, значительное число пациентов с КЛИ не подходят ни для хирургической, ни для эндоваскулярной реваскуляризации. Ангиогенные терапии становятся вариантом для этих пациентов, но в настоящее время все еще находятся под следствием. Перед применением в людях, эти терапии должны быть проверены в животных моделях и его механизмы должны быть четко поняты. Модель ишемии задних конечностей (HLI) была разработана путем перевязки и иссечения дистальных внешних подвздошных и бедренных артерий и вен у мышей. Была собрана комплексная группа тестов для оценки воздействия ишемии и предполагаемых ангиогенных методов лечения на функциональном, гистологическом и молекулярном уровнях. Лазерный Доплер использовался для измерения потока и функциональной оценки перфузии. Ткань ответ был оценен путем анализа плотности капилляров после окрашивания анти-CD31 антитела на гистологических участках гастрокнемии мышц и измерения плотности залога сосуда после диафонизации. Выражение ангиогенных генов было количественно RT-PCR ориентации отдельных ангиогенных факторов исключительно в эндотелиальных клеток (ECs) после лазерного захвата микрорассечения из мышц гастрокнемии мышей. Эти методы были чувствительными в выявлении различий между ишемическими и неишемическими конечностями и между обработанными и необработанными конечностями. Этот протокол обеспечивает воспроизводимую модель CLI и основу для тестирования ангиогенных методов лечения.
Introduction
Периферийное артериальное заболевание (ПАД) поражает преимущественно нижние конечности. PAD вызвана атеросклерозом, обструкцией артерий, которая может вызвать серьезное ограничение кровотока в нижних конечностях1. Прерывистая claudication является первым проявлением PAD и относится к мышечной боли при ходьбе. CLI является наиболее тяжелой стадии PAD, будучи диагностированы у пациентов, которые показывают ишемическую боль отдыха, язвы или гангрены2. Пациенты с CLI имеют высокий риск ампутации, особенно если не лечить3. В настоящее время реваскуляризация нижних конечностей (либо открытой хирургией, либо эндоваскулярной процедурой) является единственным способом спасти конечности. Тем не менее, около 30% пациентов CLI не подходят для этих процедур, по причинам, которые включают расположение поражений, картина артериальной окклюзии и обширной сопутствующих4,5. Таким образом, новые методы лечения необходимы для этих в противном случае неизлечимых пациентов, с продвижением ангиогенеза является стратегией под более интенсивным расследованием.
Перед тестированием на людях, эффективность и безопасность новых методов лечения in vivo должны быть рассмотрены в животных моделях. Несколько моделей были разработаны для изучения CLI, в основном путем индуцирования ишемии задних конечностей (HLI) у мышей6,7,8,9,10. Тем не менее, эти модели отличаются в нескольких аспектах, включая характер артерий, которые ligated и / или вырезаны и являются ли вены и нервы окружающих вскрыты, а6,7,8, 9,10. Взятые вместе, эти аспекты будут влиять на тяжесть ишемии реперфузии травмы в каждом животном, что делает результаты трудно сравнить. Поэтому крайне важно разработать эффективный протокол, в котором процедура индуцирования ишемии и оценка различных целей должны быть стандартизированы для оценки эффективности данной ангиогенной терапии. Экспериментальный протокол, предназначенный для охвата всех этих аспектов, обеспечит всестороннее понимание механизмов, с помощью которых ангиогенные методы лечения оказывают свое воздействие, и меру их эффективности при каждом из своих результатов. Две различные работы, недавно опубликованные нашей командой являются хорошим примером11,12, в котором различные подходы, чтобы вызвать терапевтический ангиогенез были оценены с использованием того же протокола, который будет описан с более подробно в этом Протокол.
Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы описать воспроизводимую экспериментальную модель, которая может имитировать эффекты CLI и заложить экспериментальную основу для всесторонней оценки функциональных, гистологических и молекулярных эффектов предпологаемых ангиогенных Агентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine модели CLI в основном состояли в перевязке бедренной артерии просто дистальный к происхождению profunda бедрарис 4,5,6,7,8,9. Это показало, чтобы оставить большую часть залога циркуля?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Хосе Рино и Танию Карвалью, руководителей Биоimaging фонда и гистологии и сравнительной патологии лаборатории Института Медицины Молекулярной Jo’o Лобо Antunes, соответственно. Мы также благодарим Вячеслава Сущика из кафедры анатомии Новой медицинской школы/Факулдаде-де-Сьончиас Медикас, Университет Нова-де-Лисбоа.
Справка о финансировании: проект, финансируемый UID/IC/0306/2016 Funda’o para a Ci’ncia e a Tecnologia. Паула де Оливейра поддерживается стипендией (SFRH/BD/80483/2011) от Фунданьо пара Ci’ncia e Tecnologia.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
