Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores
Summary
Aquí, se presenta un modelo experimental crítico de isquemia de la extremidad posterior seguido de una batería de pruebas funcionales, histológicas y moleculares para evaluar la eficacia de las terapias angiogénicas.
Abstract
La isquemia crítica de las extremidades (CLI) es una afección grave que implica un alto riesgo de amputación de las extremidades inferiores. A pesar de que la revascularización es la terapia estándar de oro, un número considerable de pacientes con CLI no son adecuados para la revascularización quirúrgica o endovascular. Las terapias angiogénicas están emergiendo como una opción para estos pacientes, pero actualmente todavía están bajo investigación. Antes de su aplicación en humanos, estas terapias deben probarse en modelos animales y sus mecanismos deben entenderse claramente. Un modelo animal de isquemia de la extremidad posterior (HLI) se ha desarrollado por la ligadura y la escisión de las arterias y venas externas lílicas y femorales en ratones. Se reunió un panel completo de pruebas para evaluar los efectos de la isquemia y las terapias angiogénicas putativas a nivel funcional, histológico y molecular. Laser Doppler se utilizó para la medición de flujo y la evaluación funcional de la perfusión. La respuesta del tejido se evaluó mediante el análisis de la densidad capilar después de la tinción con el anticuerpo anti-CD31 en secciones histológicas del músculo gastrocnemius y mediante la medición de la densidad colateral del vaso después de la diofonización. La expresión de genes angiogénicos se cuantificó mediante RT-PCR dirigido a factores angiogénicos seleccionados exclusivamente en células endoteliales (CE) después de la microdisección de captura láser de los músculos gastrocnemius ratones. Estos métodos fueron sensibles a la hora de identificar las diferencias entre las extremidades isquémicas y no isquémicas y entre las extremidades tratadas y no tratadas. Este protocolo proporciona un modelo reproducible de CLI y un marco para probar terapias angiogénicas.
Introduction
La enfermedad arterial periférica (PAD) afecta predominantemente a las extremidades inferiores. La PAD es causada por la aterosclerosis, una obstrucción arterial que puede causar una restricción grave al flujo sanguíneo en las extremidades inferiores1. La claudicación intermitente es la primera manifestación de la PAD y se refiere al dolor muscular al caminar. La CLI es la etapa más grave de la PAD, siendo diagnosticada enpacientes que muestran dolor isquémico de reposo, úlceras o gangrena 2. Los pacientes con CLI tienen un alto riesgo de amputación, especialmente si no se tratan3. La revascularización de las extremidades inferiores (ya sea mediante cirugía abierta o un procedimiento endovascular) es actualmente la única manera de lograr el salvamento de las extremidades. Sin embargo, alrededor del 30% de los pacientes con CLI no son adecuados para estos procedimientos, porrazones que incluyen la ubicación de las lesiones, el patrón de oclusión arterial y la amplia comorbilidad 4,5. Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias para estos pacientes de otro modo intratables, siendo la promoción de la angiogénesis la estrategia bajo una investigación más intensa.
Antes de las pruebas en humanos, la eficacia y seguridad de las nuevas terapias in vivo debe tenerse en cuenta en modelos animales. Se han desarrollado varios modelos para el estudio de la CLI, principalmente induciendo isquemia de la extremidad posterior (HLI) en ratones6,7,8,9,10. Sin embargo, estos modelos difieren en varios aspectos, incluyendo la naturaleza de las arterias que están ligadas y/o extirpadas y si las venas y los nervios que rodean también se diseccionan6,7,8, 9,10. En conjunto, estos aspectos afectarán la gravedad de la lesión por isquemia-reperfusión en cada animal, lo que dificultará la comparación de los resultados. Por lo tanto, es fundamental desarrollar un protocolo eficaz en el que se estampar el procedimiento para inducir la isquemia y la evaluación de diferentes objetivos para evaluar si una terapia angiogénica determinada será eficaz. Un protocolo experimental diseñado para abarcar todos estos aspectos proporcionaría una comprensión completa de los mecanismos por los cuales las terapias angiogénicas ejercen sus efectos y una medida de su eficacia en cada uno de sus resultados. Dos obras distintas publicadas recientemente por nuestro equipo son un buen ejemplo11,12, en el que se evaluaron diferentes enfoques para inducir la angiogénesis terapéutica utilizando el mismo protocolo que se describirá con más detalle en este Protocolo.
El objetivo general de este protocolo es describir un modelo experimental reproducible que pueda imitar los efectos de la CLI y sentar las bases experimentales para una evaluación integral de los efectos funcionales, histológicos y moleculares de la angiogena putativa Agentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los modelos murinos de CLI han consistido principalmente en la ligadura de la arteria femoral sólo distal al origen de la profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Esto ha demostrado dejar intacta la mayor parte de la circulación colateral, que restaura el flujo sanguíneo a la extremidad dentro de los 7 días 9…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a José Rino y a Tonia Carvalho, jefes del Centro de Bioimagen y del Laboratorio de Histología y Patología Comparada del Instituto de Medicina Molecular Joao Lobo Antunes, respectivamente. También agradecemos a Vyacheslav Sushchyk del Departamento de Anatomía de la Escuela de Medicina Nova/Faculdade de Ciencias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Referencia de financiación: proyecto financiado por UID/IC/0306/2016 Fundación para la Ciencia y una Tecnología. Paula de Oliveira cuenta con el apoyo de una beca (SFRH/BD/80483/2011) de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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