Оценка стабильности хранения внеклеточного везикулы
Summary
Здесь мы представляем легко применимый протокол для оценки стабильности хранения внеклеточных пузырьков, группы естественных наночастиц, производимых клетками. Пузырьки загружаются с глюкуронидазы в качестве модели фермента и хранятся в различных условиях. После хранения оцениваются их Физикохимические параметры и активность инкапсулированных ферментов.
Abstract
Внеклеточные пузырьки (EV) являются перспективными целями в текущих исследованиях, которые будут использоваться в качестве препаратов, носителей наркотиков и биомаркеров. Для их клинического развития важно не только их фармацевтическая деятельность, но и их производство должно быть оценено. В этом контексте исследования сфокусированы на изолированности электромобилей, их характеризации и хранении. Цель данной рукописи заключается в обеспечении поверхностной процедуры оценки влияния различных условий хранения на ЕДС без генетической манипуляции или специфических функциональных анализов. Это дает возможность быстро получить первое впечатление о стабильности электромобилей в условиях данного хранилища, а у электромобилей, полученных из разных источников, можно легко сравнить. Измерение устойчивости основано на физикохимических параметрах (размер, концентрация частиц и морфология) и сохранении активности их груза. Последний оценивается сапонин-опосредованной инкапсуляции фермента бета-глюкуронидазы в EV. Глюкуронидазы выступает в качестве суррогатной и позволяет легко квантификации через расщепление флуоресцентной молекулы репортера. Настоящий Протокол может быть инструментом для исследователей в поисках условий хранения, которые оптимально сохраняют свойства EV для продвижения исследований EV к клиническому применению.
Introduction
EV-мембранные наночастицы, производимые почти всеми типами клеток. Для клеток млекопитающих, EV может подразделяться на две основные группы с отдельными производственными путями1,2. Мембранные пузырьки, с размером диапазоне от примерно 100-1000 Нм, производятся прямым отпочковываясь от клеточной мембраны. Exosomes, размером 30-200 Нм, являются производными от мультивезикулярных органов формируется внутрь почек в эндосомы, которые впоследствии сливаются с клеточной мембраны выпустить несколько Exosomes одновременно. Основной функцией этих пузырьков является транспортировка информации между клетками3. С этой целью грузы, такие как РНК, ДНК и белки, активно сортируются по ним. EV может передавать различные эффекты на их цели, что имеет последствия как для здоровья, так и для состояния болезни. С одной стороны, они опосредуют положительные эффекты, такие как регенерация тканей, Презентация антигена, или антибиотик эффекты, что делает их благоприятные цели для их развития, как терапевтика4,5. С другой стороны, электромобилей может способствовать васкуляризация опухоли6, индуцировать свидетеля эффекты в стрессовой реакции7, и может играть роль в аутоиммунных заболеваний8 и воспалительных заболеваний9. Таким образом, они могут быть ключевым компонентом для лучшего понимания многих патологических эффектов. Тем не менее, наличие измененных электромобилей в многочисленных заболеваний, таких как рак10,11,12 и сердечно-сосудистые расстройства13, и их легкая доступность в крови и моче делает их идеальными Биомаркеров. Наконец, их хорошая биосовместимость14 и их неотъемлемое целевое умение делают электромобилей также интересными для доставки лекарственных препаратов15. В этой рукописи мы описываем протокол для оценки стабильности хранения электромобилей, полученных из клеток млекопитающих, что является важным свойством, которое до сих пор мало исследовано.
Для клинического развития электромобилей, есть еще много препятствий, чтобы преодолеть16, в том числе оценки их терапевтического эффекта, производство, очистка, и хранение17. В то время как-80 ° c широко рассматривается как золотой стандарт для хранения EV18, необходимые морозильные камеры стоят дорого, и поддержание требуемой холодной цепочки от производства до пациента может быть сложной задачей. Более того, в некоторых отчетах указывается, что хранение при температуре-80 °c по-прежнему не оптимально сохраняет EV и вызывает потерю функциональности EV19,20. Другие методы, такие, как замораживание сушки21,22 или сушки спрей-23, были предложены в качестве потенциальной альтернативы замороженного хранения электромобилей.
Оптимальным способом оценки стабильности хранилища является тестирование электромобилей в функциональном тесте или оценка конкретного маркера, например, их антибактериальная активность19. Это возможно при том, что желаемый эффект пузырьков известен и когда необходимо изучить одну отдельную группу электромобилей. Если сравнивать EV из различных клеточных источников (например, для инкапсуляции лекарственных средств) или если нет какого-либо известного функционального считывания, то уже невозможно оценить изменения, которые были связаны с хранением данных в прямом порядке.
С другой стороны, просто оценка изменений в их физикохимических параметров, таких как размер, восстановление частиц, и концентрация белка, не всегда предсказывают изменения в активности EV, как это было показано в недавнем патенте20.
Здесь мы предоставляем легко применимый протокол для измерения стабильности хранения электромобилей путем оценки их физикохимических параметров в сочетании с активностью инкапсулированного фермента бета глюкуронидазы в качестве суррогата для груза электромобилей. Загрузка фермента осуществляется инкубацией сапонина, мягким методом, установленным с ЕДС из разных источников21,24,25. Сапонин образует переходные поры в мембране EV, что позволяет поглощение фермента в везикул. Поскольку ферменты подвержены потере активности при неблагоприятных условиях хранения, они являются идеальным суррогатом для оценки сохранности функциональных грузов электромобилей.
Мы показали, что применение этого протокола к электромобилей, полученных из человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК), человеческих пупочных клеток эндотелия Вены (HUVECs), и человеческий аденокарцинома альвеолярных эпителиоцитов (A549) действительно приводят к большим различиям в стабильность хранения между различными линиями клеток, которые должны быть приняты во внимание при выборе источника EV21.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы представляем всеобъемлющий протокол для изучения стабильности электромобилей при различных условиях хранения. При сочетании инкапсулированной глюкуронидазы в качестве функционального считывания и оценки физикохимических параметров электромобилей, протокол поз?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
В рамках этой работы была поддержана программа исследований в области Нанпофутур, проводимая федеральным министерством образования и научных исследований Германии (номер гранта 13XP5029A). Максимилиан Рихтер был поддержан Студенистифтунг де Дойшен Волькес (немецкий академический Стипендиальный фонд) через стипендию кандидата наук.
Materials
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
