OpenProt är en fritt tillgänglig databas som verkställer en polycistronic modell av eukaryota genom. Här presenterar vi ett protokoll för användning av OpenProt databaser när förhör masspektrometri datamängder. Använda OpenProt möjliggör databas för analys av proteomiska experiment upptäckten av romanen och tidigare omätbara proteiner.
Genomet annotation är central för dagens proteomiska forskning eftersom det fäster konturerna av proteomiska landskapet. Traditionella modeller av öppna läsning ram (ORF) anteckning införa två godtyckliga kriterier: en minsta längd på 100 kodon och en enda ORF per utskrift. Ett växande antal studier rapporterar dock uttrycket av proteiner från påstås ha icke-kodande regioner, utmanande riktigheten av nuvarande genomet anteckningar. Dessa roman proteiner hittades kodas antingen inom icke-kodande RNAs, 5′ eller 3′ oöversatta regioner (utr) av mRNA eller överlappande en känd kodande sekvens (CDS) i ett alternativ ORF. OpenProt är den första databasen som verkställer en polycistronic modell för eukaryota genomen, låter annotering av flera ORFs per utskrift. OpenProt är fritt tillgängliga och erbjuder anpassade nedladdningar av proteinsekvenser över 10 arter. Använda OpenProt databas för proteomiska experiment gör romanen proteiner upptäckten och belyser polycistronic beskaffenhet eukaryota gener. Storleken på OpenProt databasen (alla förutspådde proteiner) är betydande och behöver tas i konto för analys. Dock med lämpliga falsk upptäckten hastighet (FDR) inställningar eller användning av en begränsad OpenProt databas, kommer användare att få en mer realistisk syn på proteomiska landskapet. Sammantaget är OpenProt ett fritt tillgängliga verktyg som främjar proteomiska upptäckter.
Under de senaste decennierna blivit masspektrometri (MS-) baserad proteomik gyllene tekniken att dechiffrera proteom av eukaryota celler1,2,3,4,5. Denna metod förlitar sig på nuvarande genomet anteckningar att generera en referensdatabas protein sekvens som beskriver omfattningen av möjligheter6,7,8. Dock hålla genomet anteckningar godtyckliga kriterier för ORF annotering, såsom en minsta längd på 100 kodon och en enda ORF per avskrift9,10. Ett ökande antal studier utmana den nuvarande anteckning-modellen och rapportera fynd av arter utan not funktionella ORFs i eukaryota genomen8,11,12,13, 14. Dessa nya proteiner finns kodade i påstås ha icke-kodande RNAs, i 5′ eller 3′ translaterade regioner (UTR) av mRNA eller överlappande den kanoniska kodande sekvensen (CCD: er) i en alternativ ram. Även om de flesta av dessa upptäckter har varit serendipitous, visar de förbehåll av nuvarande genomet annoteringar och eukaryota gener8polycistronic karaktär.
Här belyser vi användningen av OpenProt databaser för MS-baserad proteomik. OpenProt är den första databasen att hålla en polycistronic anteckning modell för eukaryota transcriptomes. Det är fritt tillgängliga på www.openprot.org15. En del av dessa förutspådde ORFs skulle vara slumpmässiga och icke-funktionella, varför OpenProt cumulates experimentella och funktionella bevis att öka förtroende. Experimentella bevis inkluderar proteinuttryck (MS) och översättning bevis (av Ribosomen profilering)15. Funktionella bevis inkluderar proteinet ortologiprediktion (med en i-Paranoid som strategi) och funktionell domän förutsägelse15.
OpenProt erbjuder möjligheten att ladda ner flera databaser, från innehållande endast väl stöds proteiner till skräddarsydda databaser. Här kommer vi att presentera en pipeline för användning av OpenProt databaser och kommer att erbjuda insikter om vilken databas som ska välja med tanke på syftet experimentella. Rörledningen proteomik analys presenteras här stöds av Galaxy ramen som det är öppna och lätt-till-använda, men databaserna kan arbeta med någon arbetsflöde16,17,18. Vi kommer också att presentera hur du använder webbplatsen OpenProt för insamling av ytterligare information om romanen proteiner upptäcks av MS. Using OpenProt databaser kommer att ge ett mer uttömmande bild av proteomiska landskapet och kommer att främja Proteomik och biomarkörer upptäckter i ett mer systematiskt sätt än nuvarande metoder.
Detta protokoll belyser användningen av OpenProt databaser15 när förhör MS datamängder; Det kommer inte att granska utformningen av experimentet själv, som har varit grundligt granskat någon annanstans20,21,22. I ett försök att förbli helt öppen källkod, är protokollet fritt tillgängliga (Kompletterande Material S1–S4). För lättare läsning definieras alla termer som används i OpenProt och härmed i hela detta protokoll i tabell 1.
När man analyserar data från masspektrometrar, bygger kvaliteten på proteinet identifiering delvis på riktigheten av den använda databas6,20. Nuvarande metoder använder traditionellt UniProtKB databaser, men dessa stödja genomet annotation modellen för en enda ORF per utskrift och en minsta längd på 100 kodon (med undantag för tidigare visat exempel)40. Flera studier gäller bristerna i sådana databaser med upptäckten av funktionella ORFs från påstås ha icke-kodande regioner8,11,12,13. OpenProt gör nu, för mer uttömmande protein identifiering eftersom det fäster proteinsekvenser från flera transkriptom kommentarer. OpenProt hämtar NCBI RefSeq (GRCh38.p7) och häckning (GRCh38.83) transcriptomes och UniProtKB anteckningar (UniProtKB-SwissProt, 2017-09-27)40,42,43. Som nuvarande anteckningar presenterar liten överlappning, visar OpenProt således en mer uttömmande av potentiella proteomiska landskap än när begränsad till en anteckning15.
Dessutom som OpenProt verkställer en polycistronic modell, möjliggör det flera protein anteckningar per utskrift. Statistiska och computational skäl innehar OpenProt fortfarande en minimilängd tröskel 30 kodon15. Ändå förutspår det tusentals nya proteinsekvenser, därmed utvidgning av möjligheterna för protein identifiering. Med den här metoden stöder OpenProt proteomiska upptäckter på ett mer systematiskt sätt.
Kvaliteten på proteinet identifiering kan också påverkas av de parametrar som används. MS-baserad proteomik analyser håller vanligtvis en 1% protein FDR. Men innehåller hela OpenProt databasen ca 6 gånger fler poster (figur 1). För att beakta denna betydande ökning i Sök utrymme, rekommenderar vi att du använder en strängare FDR av 0,001%. Denna parameter har optimerats med hjälp av jämförande undersökningar och manuell utvärdering av slumpmässigt utvalda spectra15. Falsk positiv är fortfarande en möjlighet, dock, och vi uppmuntrar grundlig kontroll och validering av underlagen för ett nytt protein. En rekommenderad standard kunde vara identifiering av ett protein från två olika MS körs, eftersom bakgrundsdata och falska positiva variera mellan datauppsättningar15.
Rörledningen som ges här och används för fallstudien kan ändras lika nöjd att passa experimentell design och parametrar. Vi skulle rekommendera att använda flera sökmotorer eftersom det ökar känslighet och känsligheten för peptid identifiering32. Vi uppmuntrar dessutom använder databasen bäst motsvarar syftet experimentella (figur 1). Som använder den hela OpenProt databas kommer med en stränga FDR, förloras sanna identifieringar. Alltså bör hela databasen vara avsedda för upptäckten av nya proteiner, medan klassisk proteomik profilering bör använda de mindre OpenProt databaserna (till exempel OpenProt_2pep som används i ovanstående fallstudien).
OpenProt förutspår för närvarande sekvenser som börjar med en ATG kodon, flera studier belyst översättning initiering vid andra kodon44,45. När ett nytt protein identifieras av en eller flera unika peptider, är det möjligt i sann initiering kodon inte är den förmodade ATG. Användare kan leta efter översättning bevis på webbplatsen OpenProt. För närvarande rapporterar OpenProt bara översättning händelser om de avser hela förutspådda protein sequence (100% överlappning)15. Således skulle saknas översättning bevis inte innebära proteinet inte är översatt, men att den start-kodon inte kanske den påstådda ATG.
Trots dess nuvarande begränsningar erbjuder OpenProt en mer uttömmande bild av eukaryota genomen kodning potential. OpenProt databaser främja proteomiska upptäckter och förståelsen av proteomiska funktioner och interaktioner. Framtida utvecklingen av OpenProt-databasen kommer att innehålla annotering av andra arter, översättning bevis från icke-ATG börjar codon och utveckling av en pipeline till inkluderar roman proteiner i hela genomet och exome sekvensering studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Vivian Delcourt för hans hjälp, diskussioner och råd på detta arbete. X.R. är medlem av Fonds de Recherche du Québec Santé FRQS-stödda Centre de Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Denna forskning stöddes av en Kanada forskning professur i funktionell Proteomik och upptäckten av romanen proteiner till X.R. och CIHR grant MOP-137056. Vi tackar teamet på Calcul Québec och beräkna Kanada för deras stöd med hjälp av en superdator mp2 från Université de Sherbrooke. Drift av superdatorn mp2 finansieras av den Kanada Stiftelsen av Innovation (CFI), le ministère de l’Économie, de la science et de l’innovation du Québec (MESI) och les Fonds de Recherche du Québec – natur et technologies (FRQ-NT). Den Galaxy server som användes för vissa proteomik beräkningar är delvis finansierat av Collaborative Research Centre 992 medicinsk epigenetik (DFG grant SFB 992/1 2012) och tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF beviljar 031 A538A/A538C RBC, 031L0101B /031L0101C de. NBI-epi, 031L 0106 de. TRAPPA (de. NBI)).
OpenProt website | open source | n/a | www.openprot.org |
Galaxy Server | open source | n/a | https://usegalaxy.eu/ |
TOPPview software | open source | n/a | www.openms.de |