우리는 새로운 걸음걸이 분석 시스템, 대조 강화 기록의 발 인쇄 분석 (PrAnCER), 자동으로 새로운 반투명 바닥을 활용 쥐의 보행 특성의 정량화를위한 오픈 액세스 자동화 시스템 걸음걸이를 정량화합니다. 이 시스템은 파킨슨 병의 할로페리돌 모델을 사용하여 검증되었습니다.
걸음걸이 분석은 질병의 많은 설치류 모형에 있는 운동 기능의 변경을 정량화하기 위하여 이용됩니다. 많은 연구 분야에서 걸음걸이 및 모터 기능을 평가하는 것이 중요함에도 불구하고 사용 가능한 상용 옵션은 높은 비용과 접근 가능한 개방형 코드의 부족과 같은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 보행의 자동 정량화를 위해 대비 강화 된 레코딩의 PrAnCER, 발 인쇄 분석을 개발했습니다. 대비를 강화한 레코딩은 표면에 접촉하지 않는 물체를 가리는 반투명 바닥을 사용하여 쥐의 발 인쇄를 효과적으로 분리하여 생성합니다. 이 비디오를 사용하여, 우리의 간단한 소프트웨어 프로그램은 안정적으로 시공간 보행 매개 변수의 다양한 측정합니다. PrAnCER가 운동 기능의 변화를 정확하게 감지할 수 있음을 입증하기 위해 파킨슨 병 (PD)의 할로페리돌 모델을 사용했습니다. 우리는 할로페리돌의 두 복용량에서 쥐를 테스트: 고용량 (0.30 mg/kg) 그리고 낮은 복용량 (0.15 mg/kg). Haloperidol 크게 증가 자세 기간 및 낮은 복용량 조건에서 뒷발 접촉 영역, PD 모델에서 예상 될 수 있는. 고용량 조건에서, 우리는 접촉 지역에 있는 유사한 증가 그러나 또한 보폭 길이에 있는 예기치 않은 증가를 찾아냈습니다. 추가 연구와 함께, 우리는이 증가 보폭 길이 일반적으로 haloperidol의 높은 복용량에서 관찰 브레이싱 탈출 현상과 일치 발견. 따라서, PrAnCER설치류 보행 패턴의 예상 및 예기치 않은 변화를 모두 감지할 수 있었다. 또한 걸음걸이 매개 변수의 수동 채점과 비교할 때 PrAnCER가 일관되고 정확하다는 것을 확인했습니다.
설치류는 일반적으로 관절염1,파킨슨 병 (PD) 2,3,신경 근육 장애 4,5,수두증 6을 포함한 광범위한 질병 과 부상을 연구하는 모델로 사용됩니다. 및 척수 손상7. 이러한 조건에서, 통증 과 같은 증상, 균형, 그리고 모터 기능 동물의 보행 패턴을 공부 하 여 측정될 수 있다. 이러한 패턴은 발 인쇄의 위치와 타이밍뿐만 아니라 지면의 발 접촉 영역을 요약하는 시간적 보행 매개 변수 세트를 사용하여 정량화됩니다.
보행 분석에 대한 많은 옵션이 존재하지만 현재 시스템에는 몇 가지 단점이 있습니다. 전통적인 잉크 및 종이 테스트에서 동물의 발은 흰색 종이를 가로 질러 걷기 전에잉크로 코팅됩니다 (그림 1A). 그런 다음 결과 발 인쇄를 보폭 길이및 자세 너비로 측정할 수 있지만 속도 또는 걸음 수 와 같은 주요 시간 보행 매개변수는 평가할 수 없습니다. 최신 비디오 기반 시스템은 더 안정적이지만 비디오 분석에는 적절한 자동화 시스템을 사용하지 않는한 프레임별 채점이 필요합니다 8. 현재 사용 가능한 상용 자동 채점 시스템이 많이 있지만 이러한 시스템은 엄청나게 비쌀 수 있습니다. 또한 이러한 시스템은 투명한 바닥재 나 경우에 따라 러닝 머신에 의존하며, 이 둘 다 자연스러운 움직임을 변화시웁니다. 러닝머신은 일부 질병 모델 9에서 모터적자를 마스크하는 것으로 나타났으며, 클리어 플로어링(그림1B)은마우스가 개방된 필드의 둘레에 더 많은 시간을 할애하게 하는 반면, 증가된불안(10)을나타낸다. 이상적으로, 걸음걸이 분석 장치는 동물에게 최소한의 스트레스로 가장 자연스러운 운동 패턴을 생성하는 중 하나에 의존하지 않을 것입니다.
사용 가능한 오픈 소스 및 상용 옵션은 다양한 조명 조건, 동물 색상 및 인쇄 모양에도 불구하고 동물의 몸에서 발자국을 분리하는 어려움을 극복하기 위해 다양한 방법을 사용합니다. 일부는 압력7,11,12에대한 응답으로 빛을 방출표면을 사용하여 접촉 발의 대조를 향상하지만, 이들은 비용이 많이 들고 기술적으로 구성하기 어렵다. 다른 시스템은 전신 조정의 관찰을 허용하는 다중 시야각을 활용8,13. 이러한 옵션은 걸음걸이 이외의 추가 모터 파라미터를 측정할 때 이점을 제공하지만 간단한 걸음걸이 해석을 위해 불필요하게 복잡합니다. 또한, 이러한 기술의 모든 자연 행동을 변경 명확한 바닥에 의존한다.
PrAnCER는 조명과 반투명 바닥의 조합을 사용하여 인쇄물 감지를 향상시키는 콘트라스트 강화 레코딩을 기반으로 합니다. 아래에서 보면 표면과 접촉하지 않는 물체의 뷰를 가리면서 고대비 이미지(발 인쇄)를 만듭니다(그림1D). 위에서 보면 바닥이 불투명해 보입니다. 우리의 방법에서 발의 결과 salience는 우리의 새로 개발 된 자동화 된 시스템에 의해 보행 및 운동 특성의 다양한 정확한 식별을 허용합니다. 본 연구에서는 장치, 걸음걸이 분석 프로토콜 및 자동 채점 시스템인 PrAnCER에 대해 설명합니다. 당사의 장치는 쉽게 조립되며 PrAnCER는 광범위한 질병 및 부상 모델에서 모터 적자를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
PrAnCER가 비정상적인 걸음걸이 패턴을 감지하는 데 사용될 수 있음을 입증하기 위해, 우리는 PD의 할로페리돌 모델을 사용, 운동 변화14의과도 유도를위한 간단한 모델. 할로페리돌은 항정신병제로 널리 사용되는 도파민 수용체 길항제1. 그것은 줄무늬에서 도파민 신호를 변경 하 여 모터 시스템에 영향을, 기저 중 추에 모터 경로의 중요 한 구성 요소14. 할로페리돌의 단일 용량조차도 줄무늬의 세포 외 도파민 수치를 빠르게 감소시켜 파킨슨병과 같은 운동 배변을 유발하는15. 행동 효과는 비정상적인 위치11,16에배치 된 후 정상적인 자세로 돌아갈 수없는 것으로 정의되는 근육 강성, 운동 장애 및 카탈렙시입니다. 할로페리돌의 급성 투여는 운동 기능(17)의 로타로드 시험에서식별 가능한 운동 적자를 일으킨다. 우리는 할로페리돌 매개 운동 장애도 자동 걸음걸이 분석에 접근할 수 있는 여러 가지 특성에서 분명할 것이라고 추론했습니다.
할로페리돌에 대한 반응은 연구에 따라 매우 다양하지만, 할로페리돌의 카탈로틱 효과는 0.5 mg/kg 이상으로 나타나며, 감소된 반응성과 운동 장애는 더 낮은 용량(0.1 – 0.3 mg/kg)에서 검출가능하며,16, 17. 할로페리돌의 카탈로피 효과를 피하기 위해, 우리는 할로페리돌의 두 가지 복용량을 테스트하기로 결정했습니다 : 고용량 (0.30 mg / kg) 및 낮은 복용량 (0.15 mg / kg). 표1에 나타난 바와 같이, 실험 1은 고용량 할로페리돌의 효과를 조사한 반면, 실험 2는 저용량 할로페리돌의 효과를 시험하였다. 우리는 모든 쥐가 고용량, 낮은 복용량 및 제어 (식염수) 조건에서 테스트된 내 주제 디자인을 사용했습니다. 조건의 순서는 쥐에 걸쳐 균형을 했다. 우리는 할로페리돌의 급성 투여가 속도 감소, 보폭 감소, 자세 지속 시간3,14,18 등 PD의 다른 모델에서 발견된 것과 유사한 보행 장애를 일으킬 것으로 예상했습니다. ,19. 우리는 두 복용량에서 haloperidol 행정 다음 운동 장애를 포함 하 여 행동 변화를 관찰. 낮은 복용량 조건에서, 쥐는 크게 자세 기간 및 뒷발 접촉 영역을 증가 했다, 예상 대로. 이러한 보행 변화는 PD 환자 2,20사이에서일반적인 느리고 셔플 단계와 비슷합니다. 고용량 조건에서, 그러나, 우리는 보폭 길이의 증가뿐만 아니라 발 접촉 영역의 증가를 보았다. 보폭 의 증가는 예상치 못한 것이었지만, 문헌의 추가 검토는 할로페리돌유도 브레이싱-이스케이프 반응의 일부일 가능성이 높다는 것을 나타냈다. 우리는 PrAnCER는 실제로 신경 이완제의 사용과 일치 설치류 보행에 파킨슨 병 같은 변화를 감지 할 수 있다는 결론을 내린다.
이 연구에서는 반투명 바닥을 사용하여 생성된 대비 강화 비디오를 사용하여 동물의 몸을 가리고 간단한 자동 감지를 위해 명확하게 정의된 발 인쇄를 생성하는 새로운 자동 보행 분석 시스템인 PrAnCER를 테스트했습니다. PrAnCER는 발 자국을 정확하게 식별하고 모터 기능의 변화에 민감합니다. 우리는 PD의 급성 할로페리돌 모델에서 걸음걸이 변화를 평가하기 위해 PrAnCER를 사용했습니다. haloperidol는 견고한 PD 모델의 예상 모터 적자를 유도하지 는 않았지만, 그럼에도 불구하고 PrAnCER가 걸음걸이 패턴의 변화를 정확하게 감지 할 수 있음을 입증 할 수있었습니다. 마지막으로, PrAnCER의 정확도를 정량화하고 주요 보행 매개변수의 측정이 수동 채점과 비슷하다는 것을 입증했습니다.
두 할로페리돌 치료 조건에서, 우리는 동결 행동의 높은 발생률을 관찰 (아키네시아) 실행 또는 앞으로 경계의 탈출 응답 다음. 유사근증이 여러 연구에서 유사한 용량(0.25 mg/kg)에서 관찰되었지만16,23,이러한 경계 행동은 전형적인 파킨슨병 증상3,14,19, 24. 흥미롭게도, 우리는 고용량 haloperidol 처리가 현저하게 증가한 보폭 길이 귀착되었다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 발견은 PD의 다른 할로페리돌 모델이 보폭3,19의감소를 보여주었기 때문에 처음에는 놀랐습니다. 그러나, 그들은 De Ryck 등 (1980)에 의해 설명 된 ‘브레이싱 – 탈출’행동 패턴에 비추어 의미가 있으며, 쥐가 아키네틱 기간 이후에 탈출하기 위해 달리고 달리기 및 경계와 같은 고속 걸음걸이가 증가 보폭과 관련이 있다고 보고했습니다. 길이4,25 (그림8C). 고용량 치료는 또한 뒷발의 최대 접촉 면적을 현저하게 증가시켰습니다. 저용량 할로페리돌 치료는 자세 지속 시간 및 최대 접촉 영역의 현저한증가를 포함하는 보다 특징적인 PD 보행 변화를 초래하였다(도 8A-B). 이러한 결과는 할로페리돌 유도 운동장애와 관련된 근육 강성의 반영일 수 있다.
특이한 브레이싱 이스케이프 동작에도 불구하고, 우리는 PrAnCER가 실제로 걸음걸이의 변화를 감지할 수 있다는 것을 입증할 수 있었습니다. 우리는 올바른 조명 조건에서 반투명 바닥이 발의 매우 대조적이고 상세한 이미지를 생성 할 수 있음을 보여 주었다. 본 연구에서, 우리는 벨룸으로 덮음으로써 투명한 바닥을 반투명하게 만들었습니다. 마일라와 같은 또 다른 반투명 커버링을 투명 한 바닥에 배치하면 동일한 효과를 얻을 수 있습니다. 또는, 바닥 자체는 예를 들어, 서리가 내린 플렉시 유리를 사용하여 반투명 할 수있다. 반투명 바닥과 간단한 플렉시 유리 산책로는 저렴하며 오후에 건설 할 수 있습니다. 당사의 에지 감지 기반 분석 시스템은 장치의 많은 변화에 탄력적이며 시스템을 다양한 설정, 질병 모델 또는 마우스와 같은 작은 동물에 맞게 조정 가능한 임계값을 제공합니다.
일부 보행 매개변수 분석은 보도의 측면 때문에 기존 수식에서 변경되었습니다. 예를 들어, 속도를 계산하는 우리의 방법은 다른 보행 연구와 다릅니다. LED 조명과 결합 된 반투명 바닥은 몸의 시야를 가리지 않으므로 일반적으로 수행되는 것처럼 속도를 계산하기 위해 신체 위치를 추적 할 수 없습니다. 이 연구에서는, 속도는 첫 번째 접촉에서 두 번째 접촉까지의 시간으로 같은 발의 두 접촉 사이의 이동 거리를 나누어 계산했다. 물론 다른 수식을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 전체 속도 측정이 필요한 경우 실행 시작 과 끝에 있는 포발 위치의 평균에서 거리와 실행 기간을 나눌 수 있습니다.
우리의 분석은 수동 채점과 동일하지는 않지만, 우리의 자동화 된 시스템은 높은 정확도로 수행하고 보행의 신뢰할 수있는 측정을 생성한다는 것을 확인합니다. 여기에 설명된 장치는 모터 기능의 간단하고 저렴한 분석을 위해 최적화되었습니다. 그러나 PrAnCER의 유용성을 확장하는 몇 가지 변경이 이루어질 수 있습니다. 우리 시스템의 한 가지 제한은 반투명 바닥, 우수한 발 감지를 허용하면서, 동물의 신체 축을 모호하게. 필요한 것은 찾지 못했지만 시스템에 오버헤드 카메라를 추가하여 해결할 수 있습니다. 또 다른 개선 사항은 프레임 속도가 높은 비디오 카메라를 사용하는 것입니다. 우리는 시간 적 매개 변수의 일관된 추정을 얻을 수 있었지만, 이러한 측정의 정확도는 100 fps8이하의 프레임 속도로 손상됩니다. 고속 비디오 카메라를 추가하면 시간적 측정의 정확성과 정밀도를 높이는 동시에 분석 소프트웨어를 변경할 필요가 없습니다. 또한, 여러 다른 걸음걸이 시스템은 동시에 쥐 2,8,13의측면 및 복부 뷰를 기록하기 위해 거울을 사용합니다. 이 기능을 장치에 추가하면 속도를 보다 정확하게 정량화하고 주행 중 동작을 더 잘 관찰할 수 있습니다.
이 연구에서는 반투명 바닥을 사용하면 보도 바닥과 접촉하지 않는 물체의 가시성을 차단하여 발 인쇄를 효과적으로 분리하는 것으로 나타났습니다. 우리는 발을 정확하게 식별하기 위해이 고대비 발 인쇄를 활용하는 자동 채점 시스템을 개발했습니다. 우리는 이 시스템인 PrAnCER가 상용 시스템에 필적하는 정확도로 보행 매개변수를 정량화한 것으로 나타났습니다. 우리는 할로페리돌의 고용량의 투여가 식염수에 비해 보폭 길이와 최대 접촉 면적을 증가시키는 것으로 결정했다. 이 변화는 우리가 예상한 것과 반대이지만, 기존 문헌의 추가 검토는 할로페리돌의 급성 투여에 대한 응답으로 관찰된 탈출 행동의 일부일 가능성이 있음을 나타낸다. 저용량 할로페리돌 치료는 자세 지속 시간 및 최대 접촉 영역과 같은 보다 일반적인 PD 증상을 초래했습니다. 우리는 급성 고용량 haloperidol 행정이 PD와 관련되었던 보행 손상을 공부하는 나쁜 모형인 동안, 우리의 연구 결과는 그럼에도 불구하고 모터 기능에 있는 변경을 정확하게 검출하는 PrAnCER의 기능을 설명했다는 것을 결론을 내립니다. 미래에, 우리는 그밖 질병 모형에 있는 운동 성 변경을 공부하여 PrAnCER를 더 유효하게 하는 것을 희망합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 브라운 대학에서 뇌 과학에 대한 카니 연구소에 의해 지원되었다.
Gait Walkway Apparatus | |||
1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
|
1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
|
10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
|
Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
|
RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic – clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
15 series 3 Way – Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
|
5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
“T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |