Udtryk og rensning af nuklease-fri oxygen Scavenger Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase
Summary
Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisk fjerne fri diatomisk ilt fra et vandigt system ved hjælp af dets substrat protocatechuinsyre Acid (PCA). Denne protokol beskriver udtrykket, rensning og aktivitetsanalyse af dette iltskylle enzym.
Abstract
Enkelt molekyle (SM) mikroskopi anvendes i studiet af dynamiske molekylære interaktioner af fluoroforet mærket biomolekyler i realtid. Fluorophorer er dog udsat for tab af signal via foto blegning ved opløst ilt (O2). For at forhindre foto blegning og forlænge fluoroforet levetid, er ilt scavenging Systems (OSS) ansat til at reducere O2. Kommercielt tilgængelige OSS kan være forurenet af nukleaser, der beskadiger eller nedbryder nukleinsyrer, som giver en forvirrende fortolkning af eksperimentelle resultater. Her detaljeret en protokol til ekspression og oprensning af meget aktive Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) uden påviselige nuklease kontaminering. PCD kan effektivt fjerne reaktive O2 arter ved omdannelse af substrat protocatechuinsyre Acid (PCA) til 3-carboxy-CIS, CIS-muconic Acid. Denne metode kan anvendes i ethvert vandigt system, hvor O2 spiller en skadelig rolle i dataindsamlingen. Denne metode er effektiv til at producere meget aktive, nuclease gratis PCD i sammenligning med kommercielt tilgængelige PCD.
Introduction
Et enkelt molekyle (SM) Biofysik er et hastigt voksende felt, der ændrer den måde, vi ser på biologiske fænomener. Dette felt har den unikke evne til at forbinde grundlæggende love i fysik og kemi til biologi. Fluorescens mikroskopi er en Biofysisk metode, der kan opnå SM følsomhed. Fluorescens anvendes til påvisning af biomolekyler ved at forbinde dem til små organiske fluorophorer eller kvante prikker1. Disse molekyler kan udsende fotoner, når de er ophidsede af lasere før foto blegning irreversibelt2. Foto blegning opstår, når de fluorescerende etiketter undergår kemiske skader, der ødelægger deres evne til at ophidde ved den ønskede bølgelængde2,3. Tilstedeværelsen af reaktive oxygenarter (ros) i vandig buffer er en primær årsag til foto blegning2,4. Derudover kan ros skade biomolekyler og føre til fejlagtige observationer i SM eksperimenter5,6. For at forhindre oxidativ skader, ilt scavenging Systems (OSS) kan anvendes3,7,8. Glucoseoxidase/catalase (GODCAT) systemet er effektivt til at fjerne ilt8, men det producerer potentielt skadelige peroxider som mellemprodukter. Disse kan være skadelige for biomolekyler af interesse i SM-undersøgelser.
Alternativt vil protocatechuate 3, 4 dioxygenase (PCD) effektivt fjerne O2 fra en vandig opløsning ved hjælp af dets substrat protocatechuinsyre Acid (PCA)7,9. PCD er et metalloenzym, der bruger hæm jern til at koordinere PCA og katalyserer catechol ring åbnings reaktionen ved hjælp af opløst O210. Denne ene skridt reaktion er vist sig at være en samlet bedre OSS for at forbedre fluoroforet stabilitet i SM eksperimenter7. Desværre indeholder mange kommercielt tilgængelige OSS-enzymer, herunder PCD, kontaminerende nukleaser11. Disse forurenende stoffer kan føre til beskadigelse af nukleinsyre-baserede substrater, der anvendes i SM eksperimenter. Dette arbejde vil belyse en kromatografi baseret rensnings protokol for brug af rekombinant PCD i SM-systemer. PCD kan anvendes bredt på ethvert eksperiment, hvor ROS er skadelige substrater, der er nødvendige for dataindsamling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oxygen skylle systemer er almindeligvis inkluderet i enkelt molekyle Fluorescens mikroskopi for at reducere foto blegning3,7,8. Disse mikroskopi teknikker bruges ofte til at observere nukleinsyre eller protein interaktioner med nukleinsyrer1,13,14. Kontaminering af OSSs med nukleaser kan føre til falske resultater.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH GM121284 og AI126742 til KEY.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
