तिल्ली कोशिका जीवविज्ञान और प्रत्यारोपण प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए Vascularized विषमविषय तिल्ली प्रत्यारोपण के एक माउस मॉडल
Summary
इस प्रोटोकॉल के एक माउस मॉडल के सर्जिकल कदम का विवरण vascularized विषम विषय तिल्ली प्रत्यारोपण, एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण मॉडल है कि भाग्य और तिल्ली की कोशिकाओं की दीर्घायु का अध्ययन करने में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं, अलग तिल्ली के तंत्र रोग प्रगति में सेल आबादी, और प्रत्यारोपण प्रतिरक्षा ।
Abstract
तिल्ली एक अद्वितीय लिम्फोइड अंग है जो प्रतिरक्षा और hematopoietic प्रणाली के homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । रोगियों है कि splenectomy कारण precipitating कारणों की परवाह किए बिना एक भारी के बाद splenectomy संक्रमण विकसित करने के लिए प्रवण हैं और गहरी शिरापरक घनास्त्रता और malignancies के जोखिम में वृद्धि का अनुभव. हाल ही में, महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चला कि splenectomy हृदय रोगों की घटना के साथ जुड़ा हो सकता है, सुझाव है कि तिल्ली के शारीरिक कार्यों अभी तक पूरी तरह से मान्यता प्राप्त नहीं किया गया है. यहां, हम एक माउस मॉडल के vascularized विषमविषय तिल्ली प्रत्यारोपण, जो न केवल समारोह और प्लीहा प्रतिरक्षा सेल सबसेट के विभिंन जीवविज्ञान प्रक्रियाओं में व्यवहार गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता परिचय, लेकिन यह भी एक शक्तिशाली उपकरण परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है कुछ रोगों में प्लीहा प्रत्यारोपण की चिकित्सीय क्षमता. इस मॉडल के मुख्य शल्य चिकित्सा कदम दाता तिल्ली फसल, प्राप्तकर्ता मूल तिल्ली को हटाने, और तिल्ली भ्रष्टाचार revascularization शामिल हैं । Congenic माउस उपभेदों का उपयोग करना (उदाहरण के लिए, सीडी-2/सीडी 45.2 पृष्ठभूमि के साथ चूहों), हम ने कहा कि syngeneic प्रत्यारोपण के बाद, दोनों दाता-प्लीहा लसीकाणु और माइलॉयड कोशिकाओं को भ्रष्टाचार से बाहर चले गए के रूप में के रूप में जल्दी के बाद ऑपरेटिव दिन 1, सहवर्ती प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के कई प्रकार के प्रवाह, इस प्रकार एक अद्वितीय कल्पना पैदा । अपेक्षाकृत चुनौतीपूर्ण तकनीकों के बावजूद, इस प्रक्रिया > 90% सफलता दर के साथ किया जा सकता है । इस मॉडल के भाग्य, दीर्घायु ट्रैकिंग, और स्थिर राज्य के दौरान और एक रोग एक तिल्ली प्रत्यारोपण के बाद की स्थापना में splenocytes के समारोह की अनुमति देता है, जिससे तिल्ली के लिए विशिष्ट भूमिका की खोज करने के लिए एक महान अवसर की पेशकश-प्रतिरक्षा कोशिकाओं में व्युत्पन्न विभिन्न रोग प्रक्रियाओं ।
Introduction
तिल्ली शरीर में सबसे बड़ा द्वितीयक लिम्फोइड अंग है और प्रतिरक्षा और hematopoietic सिस्टम में महत्वपूर्ण है । इसके कार्य मुख्यतः दो आकृति विज्ञान के विशिष्ट डिब्बों, लाल लुगदी और सफेद पल्प1द्वारा किए जाते हैं । लाल पल्प शिरापरक साइनस और प्लीहा डोरियों के तीन आयामी meshwork है कि एक प्रकार का तंतुक फाइबर, जालीदार कोशिकाओं से मिलकर बनता है, और जुड़े macrophages । इस अनूठी संरचना लाल लुगदी एक प्रभावी रक्त फिल्टर है कि विदेशी सामग्री और पुराने या क्षतिग्रस्त एरिथ्रोसाइट्स को हटा के रूप में कार्य करने के लिए अनुमति देता है । सफेद लुगदी कूप, सीमांत क्षेत्र, और periarteriolar लसीकापूर्ण आवरण (PALS) भी शामिल है और प्रतिजन फंसाने और प्रसंस्करण के लिए एक महत्वपूर्ण साइट है, लिम्फोसाइट homing, परिवर्तन, प्रसार, और परिपक्वता2. फिर भी, तिल्ली आमतौर पर एक अनावश्यक अंग के रूप में माना जाता है, क्योंकि अन्य लसीका अंगों, लिम्फ नोड्स के रूप में, अपने कार्यों में से कुछ को ले जा सकते हैं और तिल्ली की हानि आमतौर पर मौत के लिए नेतृत्व नहीं करता है. Splenectomy इसलिए व्यापक रूप से प्लीहा चोट या सौम्य hematologic रोगों के साथ रोगियों के लिए एक चिकित्सकीय विधि के रूप में प्रदर्शन किया गया है3. हालांकि, splenectomy के साथ रोगियों को दीर्घकालिक जटिलताओं के एक नंबर का सामना. बैक्टीरियल संक्रमण splenectomy की सबसे अच्छी पहचान की जटिलताओं हैं4,5. हाल ही में, भारी पोस्ट-splenectomy सेप्सिस splenectomy की एक गहन जटिलता के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है एक उच्च मृत्यु दर के साथ जुड़े6. इसके अलावा, हाल ही में महामारी विज्ञान के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि splenectomy हृदय रोगों की घटना के साथ जुड़ा हो सकता है, सुझाव है कि आगे तिल्ली के शारीरिक कार्यों7,8का पता लगाया जा करने के लिए रहते हैं.
दोनों तिल्ली autotransplantation और तिल्ली एलोट्रांसप्लांटेशन क्लिनिक में उपयोग किया गया है. वर्तमान में, प्लीहा अधिक ओमेन्टम में बनाया पाउच में प्लीहा ऊतक के वर्गों दाखिल द्वारा तिल्ली autotransplantation दर्दनाक splenectomy9,10के बाद प्लीहा समारोह के संरक्षण के लिए ही संभावना के रूप में माना जाता है. हालांकि, इस सर्जरी की प्रभावकारिता प्लीहा ऊतक और पश्चात के आसंजन के कारण छोटे आंत्र रुकावट के अपूतित परिगलन की तरह शल्य चिकित्सा जटिलताओं के बाद के रूप में बहस का मुद्दा11हो सकता है । तिल्ली एलोट्रांसप्लांटेशन मल्टीआंत प्रत्यारोपण12में शामिल है. Multivisceral प्रत्यारोपण से नैदानिक सबूत पता चलता है कि तिल्ली allotransplantation भ्रष्टाचार के कारण के बिना छोटे आंत्र allotransplantation अस्वीकृति में एक सुरक्षात्मक भूमिका निभा सकते है बनाम-मेजबान रोग (GVHD)12। फिर भी मल्टीआंत प्रत्यारोपण के एक घटक के रूप में तिल्ली एलोट्रांसप्लांटेशन के लाभकारी प्रभाव के बारे में साहित्य अभी तक सीमित है और अंतर्निहित तंत्र को परिभाषित किया जा करने के लिए रहते हैं. २००६ में, yair reisner एट अल. की रिपोर्ट है कि सुअर भ्रूणीय तिल्ली ऊतक कि चूहों को कोई टी कोशिकाओं है हीमोफीलिया एक इलाज सकता है, एक आनुवंशिक रोग gvhd13के कारण बिना, कि तिल्ली प्रत्यारोपण समर्थन में चिकित्सकीय वादा रखती है कुछ रोगों । इसलिए, प्लीहा प्रत्यारोपण की चिकित्सीय क्षमता पर आगे जांच की आवश्यकता है ।
तिल्ली प्रत्यारोपण के पशु मॉडल तिल्ली प्रत्यारोपण के संभावित उपचारात्मक प्रभाव का परीक्षण करने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग प्रगति में प्रतिरक्षा कोशिकाओं से व्युत्पन्न-प्लीहा के असराहना समारोह का पता लगाने के लिए मूल्यवान हैं. प्रयोगात्मक पूरे प्लीहा प्रत्यारोपण मॉडल जल्दी 1900s के बाद से प्रलेखित किया गया है, के रूप में कोहेन14द्वारा समीक्षित । १९६९ में, coburn रिचर्ड जे और ली एट अल. चूहों में तिल्ली प्रत्यारोपण की तकनीक विस्तृत15,16. हाल ही में, Swirski FK एट अल. तिल्ली प्रत्यारोपण17के एक माउस मॉडल का वर्णन किया । चूहा मॉडल की तुलना में, तिल्ली प्रत्यारोपण के माउस मॉडल अधिक अपने कई अंतर्निहित लाभों के कारण आकर्षक हैं. उदाहरण के लिए, एक माउस मॉडल का उपयोग करके, हम चूहा मॉडल के लिए अनुपलब्ध अभिकर्मकों की एक विशाल विविधता का उपयोग कर सकते हैं । इसके अलावा, congenic चूहों का उपयोग करके (उदाहरण के लिए, सीडी के साथ चूहों/सीडी 45.2 पृष्ठभूमि), एक syngeneic तिल्ली प्रत्यारोपण यह भाग्य, दीर्घायु, और splenocytes के समारोह को ट्रैक करने के लिए संभव बनाता है18. Swirski FK एट अल.17द्वारा काम के आधार पर, हम आगे चूहों में प्लीहा प्रत्यारोपण के इस सरलीकृत और बढ़ाया प्रोटोकॉल की स्थापना की । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एक मानकीकृत तरीके से दोनों विश्वसनीयता और व्यवहार्यता को जोड़ती है और एक उपकरण के लिए तिल्ली जीवविज्ञान और प्रत्यारोपण प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
संमोहक सबूत पता चलता है कि तिल्ली-monocytes बाँझ भड़काऊ प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं जैसे atherosclerosis के रूप में19, तीव्र इस्कीमिक मस्तिष्क20 या फेफड़ों की चोट18, साथ ही ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय व्यापक प्रत्यारोपण केंद्र और संसाधन और वित्तीय सहायता के लिए Feinberg चिकित्सा अनुसंधान कोर कार्यक्रम के स्कूल धंयवाद । विशेष रूप से, प्रवाह कोशिका मिति और प्रोटोकॉल सेवाओं नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय फ्लो Cytometry कोर सुविधा और माउस प्रोटोकॉल और Phenotyping प्रयोगशाला, क्रमशः द्वारा प्रदान की गई, दोनों जिनमें से NCI द्वारा समर्थित है P30-CA060553 रॉबर्ट एच को संमानित किया गया Lurie व्यापक कैंसर केंद्र । हम इस पांडुलिपि की अशुद्धि जांचने के लिए श्री नैट एस्पार्ज़ा को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Ketamine | Wyeth | 206205-01 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | |
| Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Injection grade normal saline | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-20 | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc. | 111000140 | |
| ThermoCare Small Animal ICU System | Thermocare, Inc. | ||
| Adson Forceps | Roboz Surgical Instruments | RS-5230 | |
| Derf Needle Holder | Roboz Surgical Instruments | RS-7822 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instruments | RS-5881 | |
| Micro-clip | Roboz Surgical Instruments | RS-5420 | |
| 7-0 silk | Braintree Scientific | SUT-S 103 | |
| 11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle | Sharpoint DR4 | AK-2119 | |
| Ms CD45.2 antibody | BD Bioscience | 553772 | |
| Ms CD45.1 antibody | BD Bioscience | 553776 | |
| Ms CD11b antibody | BD Bioscience | 557657 | |
| Ms B220 antibody | BD Bioscience | 553089 | |
| Ms Ly6C antibody | eBioscience | 48-5932-80 | |
| Ms Ly6G antibody | BD Bioscience | 561236 | |
| Ms F4/80 antibody | BD Bioscience | 565614 | |
| Ms CD11c antibody | BD Bioscience | 558079 | |
| Ms CD3 antibody | eBioscience | 48-0032-82 | |
| Ms CD4 antibody | BD Bioscience | 552051 | |
| Ms CD8 antibody | BD Bioscience | 563786 | |
| LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L34955 |
References
- Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34 (5), 455-465 (2006).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9 (9), 428-437 (2017).
- Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99 (2), 392-398 (2014).
- Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95 (48), e5098 (2016).
- Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome – review study. International Journal of Surgery. 12 (12), 1314-1316 (2014).
- Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy – a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102 (8), 1333-1341 (2017).
- Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114 (14), 2861-2868 (2009).
- Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19 (2), 156-161 (2012).
- Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78 (3), 270-278 (1991).
- Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73 (2), 83-86 (1991).
- Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246 (3), 436-444 (2007).
- Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (50), 19075-19080 (2006).
- Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69 (6), 777-784 (1954).
- Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8 (1), 86-88 (1969).
- Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65 (3), 436-439 (1969).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325 (5940), 612-616 (2009).
- Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2833-2847 (2018).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
- Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), 1411-1419 (2014).
- Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39 (5), 806-818 (2013).
- Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18 (2), 1470320317706653 (2017).
- Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 62 (2016).
- Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200 (6), 1982-1987 (2018).
