Hier stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung von frischem Knochenmark (BM) vor, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, um die analyse von Neutrophilenzellen durch die hochdimensionale Massenzytometrie (Cytometrie durch Time-Of-Flight, CyTOF) zu verarbeiten.
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Methodenartikel
Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll vor, das optimiert ist, um Neutrophilen-Linienzellen in frischem BM für die gesamte BM CyTOF-Analyse zu erhalten. Wir nutzten ein myeloisch-voreingenommenes 39-Antikörper-CyTOF-Panel, um das hämatopoetische System mit einem Fokus auf die Neutrophilen-Linienzellen mit diesem Protokoll zu bewerten. Das CyTOF-Ergebnis wurde mit einem Open-Resource-Dimensionsreduktionsalgorithmus viSNE analysiert, und die Daten wurden vorgestellt, um das Ergebnis dieses Protokolls zu demonstrieren. Wir haben neue neutrophil-lineage Zellpopulationen auf der Grundlage dieses Protokolls entdeckt. Dieses Protokoll der frischen gesamten BM-Präparation kann für 1), CyTOF-Analyse verwendet werden, um nicht identifizierte Zellpopulationen aus ganz BM zu entdecken, 2), die Untersuchung ganzer BM-Defekte bei Patienten mit Bluterkrankungen wie Leukämie, 3), fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrieprotokolle, die frische sermierte bm verwenden.
Einleitung
In den letzten Jahrzehnten waren Zytometrie-Methoden ein leistungsfähiges Werkzeug, um das hämatopoetische System im BM zu untersuchen. Zu diesen Methoden gehören fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie und die neue Methode der CyTOF mit schwermetallbeschriftten Antikörpern. Sie haben durch die Identifizierung ihrer einzigartigen Oberflächenmarker-Expressionsprofile zu Entdeckungen vieler Zelltypen in einer heterogenen biologischen Probe geführt. Erhöhte Spektrumüberlappungen, die mit mehr Kanälen verbunden sind, führen zu einer höheren Datenungenauigkeit in fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrieanwendungen. Daher werden unerwünschte Zellen routinemäßig entfer....
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Protokoll
Alle Experimente folgten den anerkannten Richtlinien des La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care and Use Committee, und die Zulassung für die Verwendung von Nagetieren wurde vom La Jolla Institute for Allergy and Immunology nach Kriterien gemäß den der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health.
1. Ernte Maus Knochenmark (BM)
- Kaufen Sie C57BL/6J Mäuse von einem kommerziellen Anbieter. Füttern Sie die Standard-Nagetier-Chow-Diät und beherbergen Sie sie in Mikroisolatorkäfigen in einer pathogenenfreien Anlage.
- Verwenden Sie männliche Mäuse, 6-10 Wochen al....
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Ergebnisse
Abbildung 1 wird als Beispiel aus CyTOF-Experimenten dargestellt. Auf diesem tSNE-Diagramm wurden die Zellen über mehrere Mausgewebe basierend auf der Ähnlichkeit ihrer Oberflächenmarker-Expressionsprofile, die von einem CyTOF-Panel mit 33 Parametern gemessen wurden, in Teilmengen gruppiert. Zellen mit ähnlichen Eigenschaften wurden automatisch gruppiert, z. B. Die Neutrophile, Makrophagen oder die DCs basierend auf der Expression der 33 Marker auf jeder Zelle.
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Diskussion
In den vergangenen Jahrzehnten wurde die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie als Hauptmethode zur Untersuchung zellulärer Abstammungundlzeichen und Heterogenität1,2,3verwendet. Obwohl die Durchflusszytometrie mehrdimensionale Daten lieferte, ist diese Methode durch die Auswahl von Parametern und spektralen Überlappungen eingeschränkt. Um die Schwäche der Durchflusszytometrie zu überwinden, nutzten wir CyTOF, das schwere Met.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken dem LJI Flow Cytometry Kern für die Unterstützung bei der Massenzytometrie. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R01HL134236, P01HL136275 und R01CA202987 (alle an C.C.H) und ADA7-12-MN-31 (04) (zu C.C.H. und Y.P.Z) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CyTOF Antikörper (Maus) | |||
| Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Mensch/Maus CD45R/B220 (Klon RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-Maus CD105 (Klon MJ7/18)-gereinigt | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-Maus CD115 (CSF-1R) (Klon AFS98)-gereinigte | Biolegende | Kat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Maus CD117/c-kit (Klon 2B8)-166Er | Fluidigm | Kat# 3166004B | |
| Anti-Maus CD11a (Klon M17/4)-gereinigt | Biolegend | Kat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Maus CD11b (Klon M1/70)-148Nd | Fluidigm | Kat# 3148003B | |
| Anti-Maus CD11c (Klon N418)-142Nd | Fluidigm | Kat# 3142003B | |
| Anti-Maus CD127 (IL-7Rα) (Klon A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Kat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Maus CD150 (Klon TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-Maus CD16.2 (Fcγ RIV) (Klon 9E9)-gereinigte | Biolegende | Kat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Maus CD162 (Klon 4RA10 (RUO)) - gereinigt | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-Maus CD169 (Siglec-1) (Klon 3D6.112)-gereinigte | Biolegende | Kat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-Maus-CD182 (CXCR2) (Klon SA044G4)-gereinigte | Biolegende | Kat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-Maus-CD183 (Klon CXCR3-173)-gereinigte | Biolegend | Kat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-Maus CD335 (NKp46) (Klon 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-Maus CD34 (Klon MEC14.7)-gereinigte | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-Maus CD41 (Klon MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Maus CD43 (Klon S11)-146Nd | Fluidigm | Kat# 3146009B | |
| Anti-Maus CD48 (Klon HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Kat# 3156012B | |
| Anti-Maus CD62L (Klon MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Kat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-Maus CD71 (Klon RI7217)-Gereinigte | Biolegend | Kat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-Maus CD90 (Klon G7)-gereinigte | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Maus F4/80 (Klon BM8)-159TB | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-Maus Fcε RIα (Klon MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-Maus-GM-CSF (MP1-22E9 (RUO)) - gereinigt | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Maus I-A/I-E (Klon M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Kat# 3174003B | |
| Anti-Maus Ki67 (Klon B56 (RUO))-gereinigt | BD Biosciences | Kat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) (Klon D7)-169Tm | Fluidigm | Kat# 3169015B | |
| Anti-Maus Ly6B (Klon 7/4)-Gereinigter | Abcam | Kat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-Maus Ly-6G (Klon 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Maus NK1.1 (Klon PK136)-165Ho | Fluidigm | Kat# 3165018B | |
| Anti-Maus Siglec-F (Klon E50-2440 (RUO))-gereinigt | BD Biosciences | Kat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Maus TCRβ (Klon H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Klon H57-597)-143Nd | |
| Anti-Maus TER-119/Erythroide Zellen (Klon TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine | |||
| Antikörper-Stabilisator | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x Erythrozyten-Lysepuffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Vier-Element-Kalibrierperlen | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fötales Rinderserum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphat gepufferte Kochsalzlösung | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antikörpermarkierungskits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Natriumazid | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimentelles Modell: Organismus/Stämme | |||
| Maus: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Best.-Nr.: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | Cytobank https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten und Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Referenzen
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
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Nachdrucke und Genehmigungen
