Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based
Summary
Cette approche moléculaire pour déterminer la forme physique bactérienne facilite la détection précise et précise des micro-organismes à l’aide de codes-barres d’ADN génomique uniques qui sont quantifiés par l’intermédiaire du PCR numérique. Le protocole décrit le calcul de l’indice concurrentiel des souches de Salmonella; cependant, la technologie est facilement adaptable aux protocoles exigeant la quantification absolue de n’importe quel organisme génétiquement malléable.
Abstract
Un indice concurrentiel est une méthode courante utilisée pour évaluer la condition physique bactérienne et/ou la virulence. L’utilité de cette approche est illustrée par sa facilité à effectuer et sa capacité à normaliser la condition physique de nombreuses souches à un organisme de type sauvage. La technique est toutefois limitée par les marqueurs phénotypiques disponibles et le nombre de souches qui peuvent être évaluées simultanément, ce qui crée la nécessité d’un grand nombre d’expériences de repli. Parallèlement à un grand nombre d’expériences, les coûts de main-d’œuvre et de matériaux pour quantifier les bactéries à partir de marqueurs phénotypiques ne sont pas négligeables. Pour surmonter ces aspects négatifs tout en conservant les aspects positifs, nous avons développé une approche moléculaire pour quantifier directement les micro-organismes après l’ingénierie des marqueurs génétiques sur les chromosomes bactériens. Unique, 25 paires de base codes-barres d’ADN ont été insérés à un locus inoffensif sur le chromosome des souches sauvages de type et mutant de Salmonella. Des expériences de compétition in vitro ont été réalisées à l’aide d’inocula composées de souches mises en commun. Après la compétition, les nombres absolus de chaque souche ont été quantifiés à l’aide de PCR numérique et les indices concurrentiels pour chaque souche ont été calculés à partir de ces valeurs. Nos données indiquent que cette approche pour quantifier Salmonella est extrêmement sensible, précise et précise pour détecter à la fois des micro-organismes très abondants (haute condition physique) et rares (faible condition physique). En outre, cette technique est facilement adaptable à presque n’importe quel organisme avec des chromosomes capables de modification, ainsi qu’à diverses conceptions expérimentales qui nécessitent une quantification absolue des micro-organismes.
Introduction
L’évaluation de la condition physique et de la virulence des organismes pathogènes est un aspect fondamental de la recherche en microbiologie. Il permet de faire des comparaisons entre les souches ou entre les organismes mutés, ce qui permet aux chercheurs de déterminer l’importance de certains gènes dans des conditions spécifiques. Traditionnellement, l’évaluation de la virulence utilise un modèle animal d’infection à l’aide de différentes souches bactériennes et en observant les résultats de l’animal infecté (p. ex. Dose infectieuse50, Dose létale50, temps de mort, sévérité des symptômes, absence de symptômes, etc.). Cette procédure fournit des descriptions précieuses de la virulence, mais elle exige des souches de causer des différences considérables dans les résultats afin de détecter les variations de type sauvage. En outre, les résultats sont semi-quantitatifs parce que si la progression de la maladie et la gravité des symptômes peuvent être subjectivement quantifiées au fil du temps, l’interprétation de la virulence par rapport au type sauvage est plus qualitative (c.-à-d. plus, moins, ou tout aussi virulente). Une alternative commune aux essais d’infectiosité animale est de générer des indices concurrentiels (CI), des valeurs qui comparent directement la forme physique ou la virulence d’une souche à une contrepartie de type sauvage dans une infection mixte1. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport à un modèle animal traditionnel d’infection en standardisant la virulence d’une souche de type sauvage et en déterminant une valeur quantifiable pour refléter le degré d’atténuation. Cette technique peut également être adaptée pour analyser les interactions génétiques chez les bactéries en déterminant un indice concurrentiel annulé (COI)2. Le calcul d’un ICO pour un groupe d’organismes mutés permet aux chercheurs de déterminer si deux gènes contribuent indépendamment à la pathogénie ou s’ils sont impliqués dans la même voie de virulence et dépendent les uns des autres. En outre, le calcul d’un CI nécessite l’énumération des bactéries qui peuvent fournir des informations précieuses sur la pathogénie des organismes. Les IC et les IC permettent également aux chercheurs d’asses souches avirulentes qui ne causent pas de maladie clinique, mais qui ont encore des différences de condition physique. Cette technique est limitée par l’utilisation de marqueurs traditionnels de résistance aux antibiotiques pour identifier les souches, limitant ainsi le nombre de souches d’entrée à seulement une ou deux à la fois. En raison de cette limitation, un grand nombre de groupes expérimentaux et de répliques sont nécessaires, ce qui, en plus d’augmenter les coûts de main-d’œuvre et de matériaux, augmente également les possibilités de variabilité dans les conditions expérimentales et les résultats inexacts. (Pour un examen approfondi des avantages et des applications de l’utilisation d’infections mixtes pour étudier la virulence, la condition physique et les interactions génétiques, voir C.R. Beuzon et D.W. Holden 1)
Des tentatives ont été faites pour surmonter cette limitation, comme l’utilisation de cellules fluorescentes quantifiées par cytométrie de flux3,4,5. Cette technique quantifie les cellules à l’aide d’anticorps étiquetés 1) à des marqueurs phénotypiques ou 2) de protéines fluorescentes produites endogènement. L’utilisation d’anticorps étiquetés a une limite de détection de 1000 cellules/mL, et nécessite donc un grand nombre de cellules pour analyser3. Les cellules exprimant des protéines fluorescentes ont une physiologie altérée et sont sensibles aux changements de forme physique résultant de l’expression riche en protéines6. Les deux méthodes sont limitées par le nombre de marqueurs fluorescents détectables à l’aide de la cytométrie du débit. Un progrès dans la quantification moléculaire a été réalisé par le développement d’une technique de microarray qui a détecté l’atténuation dans 120 souches d’une infection mélangée initiale de plus de 1.000 souches dans un modèle de murine7. Cette technique a utilisé une analyse de microarray de l’ARN des souches mutées, qui mènent à la variabilité considérable dans le résultat. Néanmoins, il a établi que de grands bassins d’infections mixtes peuvent être un outil utile et qu’en utilisant des techniques de détection sensibles, des différences dans la virulence bactérienne peuvent être identifiées. Avec le développement du séquençage de la prochaine génération, Tn-seq a élargi l’utilité des mutations transposon, permettant une méthode puissante pour quantifier les bactéries qui ont été mutées au hasard8,9,10, 11. Un protocole alternatif a été récemment développé qui élimine le besoin de transposons et utilise plutôt des codes-barres d’ADN pour identifier et suivre plus facilement les changements génomiques et leur impact sur la condition physique12. Cette technologie est un progrès majeur, mais l’insertion des codes à barres génomiques est encore un processus aléatoire. Pour surmonter le caractère aléatoire des expériences précédentes, Yoon et coll. ont mis au point une méthode pour calculer les IC des souches de Salmonella à l’aide de codes-barres d’ADN uniques insérés à des endroits précis sur les chromosomes des bactéries13. Des souches à code à barres uniques ont été détectées à l’aide d’une méthode qPCR avec sYBR vert et amorces spécifiques à chaque code-barres unique. La technique a été limitée par des contraintes imposées par qPCR, y compris des différences dans l’efficacité des amorces et une faible sensibilité, comme en témoigne la nécessité de l’imminance-PCR avant qPCR. Néanmoins, cette approche a démontré que des modifications génomiques ciblées pouvaient être exploitées pour détecter et quantifier potentiellement des bassins de souches bactériennes multiples.
Dans le protocole suivant, nous décrivons une nouvelle méthodologie pour effectuer des expériences de compétition bactérienne avec de grands pools d’inocula mélangés suivis d’une quantification précise à l’aide d’une technique de PCR numérique très sensible. Le protocole consiste à étiqueter génétiquement les souches bactériennes avec un code-barres unique d’ADN inséré sur une région inoffensive du chromosome. Cette modification permet aux souches d’être rapidement et avec précision quantifiées à l’aide de la technologie moléculaire moderne au lieu des dilutions en série traditionnelles, du placage de réplique et du comptage des unités de formation de colonies qui reposent sur des marqueurs phénotypiques (c.-à-d. résistance aux antibiotiques ). Les modifications permettent d’évaluer simultanément de nombreuses souches dans un seul inoculum mis en commun, réduisant considérablement la possibilité de variabilité expérimentale parce que toutes les souches sont exposées aux mêmes conditions exactes. En outre, bien que cette technique ait été développée dans Salmonella enterica serovar Typhimurium, elle est très adaptable à tout organisme génétiquement malléable et presque à toute conception expérimentale où des numérations bactériennes précises sont nécessaires, fournissant une nouvelle d’augmenter la précision et le débit dans les laboratoires de microbiologie sans les contraintes imposées par les méthodes précédentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité de quantifier avec précision les microorganismes est d’une importance primordiale pour la recherche en microbiologie, et la capacité d’énumérer des souches uniques d’une population mixte initiale s’est avérée être un outil inestimable pour évaluer les traits de forme physique et de virulence dans bactérie. Cependant, les techniques pour y parvenir n’ont pas progressé dans le rythme des développements modernes en biologie moléculaire. La technologie pour modifier facilement les chromosomes de nomb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les recherches rapportées dans cette publication ont été appuyées par le Fonds de recherche du président george F. Haddix et le National Institute of General Medical Science des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de prix GM103427. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
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