Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen
Summary
Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.
Abstract
Ein Wettbewerbsindex ist eine gängige Methode zur Beurteilung der bakteriellen Fitness und/oder Virulenz. Der Nutzen dieses Ansatzes wird durch seine Leichtigkeit zu erfüllen und seine Fähigkeit, die Fitness vieler Stämme auf einen wilden Organismus zu standardisieren veranschaulicht. Die Technik wird jedoch durch verfügbare phänotypische Marker und die Anzahl der Stämme begrenzt, die gleichzeitig bewertet werden können, was die Notwendigkeit für eine große Anzahl von Replikationsexperimenten erzeugt. Gleichzeitig mit einer großen Anzahl von Experimenten sind die Arbeits- und Materialkosten für die Quantifizierung von Bakterien auf der Grundlage von phänotypischen Markern nicht unerheblich. Um diese negativen Aspekte zu überwinden und gleichzeitig die positiven Aspekte beizubehalten, haben wir einen molekularbasierten Ansatz entwickelt, um Mikroorganismen direkt nach technischen genetischen Markern auf bakterielle Chromosomen zu quantifizieren. Einzigartige, 25 Basispaar-DNA-Barcodes wurden an einem harmlosen Ort auf dem Chromosom von Wildtyp- und mutierten Salmonellenstämmen eingefügt. In-vitro-Wettbewerbsexperimente wurden mit Inocula durchgeführt, die aus gepoolten Stämmen bestehen. Im Anschluss an den Wettbewerb wurden die absoluten Zahlen der einzelnen Stämme anhand der digitalen PCR quantifiziert, und die Wettbewerbsindizes für jede Sorte wurden aus diesen Werten berechnet. Unsere Daten deuten darauf hin, dass dieser Ansatz zur Quantifizierung von Salmonellen äußerst empfindlich, genau und präzise ist, um sowohl sehr reichlich (hohe Fitness) als auch seltene (niedrige Fitness) Mikroorganismen zu erkennen. Darüber hinaus ist diese Technik leicht an nahezu jeden Organismus mit modifizierenden Chromosomen sowie an verschiedene experimentelle Konstruktionen anpassbar, die eine absolute Quantifizierung von Mikroorganismen erfordern.
Introduction
Die Beurteilung von Fitness und Virulenz pathogener Organismen ist ein grundlegender Aspekt der mikrobiologischen Forschung. Es ermöglicht Vergleiche zwischen Stämmen oder zwischen mutierten Organismen, was es Forschern ermöglicht, die Bedeutung bestimmter Gene unter bestimmten Bedingungen zu bestimmen. Traditionell nutzt die Virulenzbewertung ein tierisches Infektionsmodell mit verschiedenen Bakterienstämmen und beobachtet das Ergebnis des infizierten Tieres (z. B. Infektiöse Dosis50, Tödliche Dosis50, Zeit bis zum Tod, Symptomschwere, Symptome usw.). Dieses Verfahren liefert wertvolle Beschreibungen der Virulenz, erfordert jedoch, dass Stämme erhebliche Unterschiede in den Ergebnissen verursachen, um Variationen vom Wildtyp zu erkennen. Darüber hinaus sind die Ergebnisse semiquantitativ, da die Krankheitsprogression und die Symptomschwere im Laufe der Zeit subjektiv quantifiziert werden können, die Interpretation der Virulenz im Vergleich zum Wildtyp qualitativer ist (d. h. mehr, weniger oder gleich virulent). Eine häufige Alternative zur Durchführung von Tierinfektivitätstests besteht darin, wettbewerbsfähige Indizes (CIs) zu generieren, Werte, die Die Fitness oder Virulenz eines Stammes direkt mit einem Wildtyp-Gegenstück in einer gemischten Infektion vergleichen1. Diese Technik hat zahlreiche Vorteile gegenüber einem traditionellen Tiermodell der Infektion, indem sie Virulenz auf einen Wildstamm standardisiert und einen quantifizierbaren Wert bestimmt, der den Grad der Dämpfung widerspiegelt. Diese Technik kann auch angepasst werden, um Genwechselwirkungen in Bakterien zu analysieren, indem ein aufgehobener Wettbewerbsindex (COI)2ermittelt wird. Die Berechnung eines COI für eine Gruppe mutierter Organismen ermöglicht es den Forschern zu bestimmen, ob zwei Gene unabhängig voneinander zur Pathogenese beitragen oder ob sie an demselben Virulenzweg beteiligt und voneinander abhängig sind. Darüber hinaus erfordert die Berechnung eines CI die Aufzählung von Bakterien, die wertvolle Einblicke in die Pathogenese von Organismen liefern können. CIs und COIs ermöglichen es Forschern auch, avirulente Stämme zu asses, die keine klinischen Krankheiten verursachen, aber immer noch Unterschiede in der Fitness haben. Diese Technik wird durch die Verwendung von traditionellen Antibiotikaresistenzmarkern zur Identifizierung von Stämmen eingeschränkt, wodurch die Anzahl der Eingangsstämme auf jeweils nur ein oder zwei begrenzt wird. Aufgrund dieser Einschränkung sind eine große Anzahl von experimentellen Gruppen und Replikationen erforderlich, was neben der Erhöhung der Arbeits- und Materialkosten auch die Chancen für Variabilität unter experimentellen Bedingungen und ungenaue Ergebnisse erhöht. (Für eine gründliche Überprüfung der Vorteile und Anwendungen der Verwendung von gemischten Infektionen zur Untersuchung von Virulenz, Fitness, und Gen-Wechselwirkungen, siehe C.R. Beuzén und D.W. Holden 1)
Es wurde versucht, diese Einschränkung zu überwinden, wie z. B. die Verwendung fluoreszierend markierter Zellen, die über die Durchflusszytometrie3,4,5quantifiziert werden. Diese Technik quantifiziert Zellen mit entweder 1) markierten Antikörpern gegen phänotypische Marker oder 2) endogen produzierten fluoreszierenden Proteinen. Die Verwendung von markierten Antikörpern hat eine Nachweisgrenze von 1.000 Zellen/ml und erfordert daher eine hohe Anzahl von Zellen, um3zu analysieren. Zellen, die fluoreszierende Proteine exezieren, haben eine veränderte Physiologie und sind anfällig für Fitnessveränderungen infolge einer hohen Proteinexpression6. Beide Methoden sind durch die Anzahl der fluoreszierenden Marker begrenzt, die mit Derdurchflusszytometrie nachweisbar sind. Ein Fortschritt in der molekularen Quantifizierung wurde durch die Entwicklung einer Mikroarray-Technik erreicht, die Dämpfung in 120 Stämmen aus einer anfänglichen gemischten Infektion von über 1.000 Stämmen in einem murinen Modell7erkannte. Diese Technik nutzte eine Mikroarray-Analyse von RNA aus mutierten Stämmen, die zu einer erheblichen Variabilität des Ergebnisses führten. Dennoch stellte sie fest, dass große Pools gemischter Infektionen ein nützliches Werkzeug sein können und dass durch den Einsatz empfindlicher Nachweistechniken Unterschiede in der bakteriellen Virulenz identifiziert werden können. Mit der Entwicklung der Sequenzierung der nächsten Generation erweiterte Tn-seq den Nutzen von Transposonmutationen und ermöglichte eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Bakterien, die nach dem Zufallsprinzip mutiert waren8,9,10, 11. Kürzlich wurde ein alternatives Protokoll entwickelt, das Transposons überflüssig macht und stattdessen DNA-Barcodes verwendet, um genomische Veränderungen und ihre Auswirkungen auf die Fitness leichter zu identifizieren und zu verfolgen12. Diese Technologie ist ein großer Fortschritt, aber das Einfügen der genomischen Barcodes ist immer noch ein zufälliger Prozess. Um die Zufälligkeit früherer Experimente zu überwinden, entwickelten Yoon et al. eine Methode zur Berechnung der CIs von Salmonellenstämmen mithilfe einzigartiger DNA-Barcodes, die an präzisen Stellen auf den Chromosomen von Bakterien eingefügt wurden13. Einzigartige Barcode-Stämme wurden mit einer qPCR-basierten Methode mit SYBR-Grün und Primern, die für jeden eindeutigen Barcode spezifisch sind, erkannt. Die Technik wurde durch die von qPCR auferlegten Einschränkungen eingeschränkt, einschließlich Unterschieden in der Primer-Effizienz und der geringen Empfindlichkeit, was durch die Notwendigkeit von geschachtelter PCR vor qPCR belegt wird. Dennoch zeigte dieser Ansatz, dass gezielte genomische Modifikationen für den Nachweis und die potentielle Quantifizierung von Pools mehrerer Bakterienstämme genutzt werden könnten.
Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine neuartige Methodik zur Durchführung bakterieller Wettbewerbsexperimente mit großen Pools gemischter Inocula, gefolgt von einer genauen Quantifizierung mit einer hochsensiblen digitalen PCR-Technik. Das Protokoll beinhaltet die genetische Kennzeichnung von Bakterienstämmen mit einem einzigartigen DNA-Barcode, der auf eine harmlose Region des Chromosoms eingefügt wird. Diese Modifikation ermöglicht eine schnelle und genaue Quantifizierung von Stämmen mithilfe moderner molekularer Technologie anstelle herkömmlicher serieller Verdünnungen, Nachahmung und Zählen von Koloniebildenden Einheiten, die auf phänotypischen Markern basieren (d. h. Antibiotikaresistenz ). Die Modifikationen ermöglichen die gleichzeitige Bewertung vieler Stämme in einem einzigen gepoolten Inokulum, wodurch die Möglichkeit einer experimentellen Variabilität erheblich reduziert wird, da alle Stämme genau den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind. Während diese Technik in Salmonella enterica serovar Typhimurium entwickelt wurde, ist sie hochgradig anpassungsfähig an jeden genetisch verformbaren Organismus und nahezu jedes experimentelle Design, bei dem genaue Bakterienzahlen erforderlich sind, was eine neue Werkzeug zur Erhöhung der Genauigkeit und des Durchsatzes in mikrobiologischen Laboratorien ohne die Einschränkungen, die durch frühere Methoden auferlegt wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fähigkeit, Mikroorganismen genau zu quantifizieren, ist für die mikrobiologische Forschung von größter Bedeutung, und die Fähigkeit, einzigartige Stämme aus einer anfänglichen gemischten Population aufzuzählen, hat sich als ein unschätzbares Instrument zur Bewertung von Fitness- und Virulenzmerkmalen in bakterien. Die Techniken dazu sind jedoch nicht im Schritttempo mit den modernen Entwicklungen in der Molekularbiologie vorangekommen. Die Technologie, um die Chromosomen vieler Bakterien, einschließlich <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom George F. Haddix President es Faculty Research Fund und dem National Institute of General Medical Science der National Institutes of Health (NIH) unter der Nummer GM103427 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
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