Digitalt PCR-baserat konkurrens index för högt dataflöde analys av lämplighet för salmonella
Summary
Denna molekyl-baserade metod för bestämning av bakteriell kondition underlättar exakt och noggrann detektion av mikroorganismer med hjälp av unika genomiska DNA-streckkoder som kvantifieras via digital PCR. I protokollet beskrivs beräkning av konkurrens index för salmonella stammar. tekniken är dock lätt att anpassa till protokoll som kräver absolut kvantifiering av varje genetiskt formbar organism.
Abstract
Ett konkurrenskraftigt index är en vanlig metod som används för att bedöma bakteriell kondition och/eller virulens. Nyttan av detta tillvägagångssätt exemplifieras av dess lätthet att utföra och dess förmåga att standardisera lämplighet många stammar till en vild-typ organism. Tekniken är dock begränsad av tillgängliga fenotypiska markörer och antalet stammar som kan bedömas samtidigt, vilket skapar behovet av ett stort antal replikeringsexperiment. Samtidigt med ett stort antal experiment är arbets-och materialkostnaderna för att kvantifiera bakterier baserade på fenotypiska markörer inte obetydliga. För att övervinna dessa negativa aspekter och samtidigt behålla de positiva aspekterna har vi utvecklat en molekylär-baserad metod för att direkt kvantifiera mikroorganismer efter tekniska genetiska markörer på bakteriella kromosomer. Unika, 25 bas par DNA-streckkoder sattes in på en ofarlig Locus på kromosomen av vildtyp och Mutant stammar av salmonella. In vitro-konkurrens experiment utfördes med hjälp av inokulat bestående av poolade stammar. Efter tävlingen kvantifierades det absoluta antalet av varje stam med hjälp av digital PCR och konkurrens indexen för varje stam beräknades utifrån dessa värden. Våra data tyder på att denna metod för att kvantifiera salmonella är extremt känslig, noggrann och exakt för att upptäcka både mycket riklig (hög kondition) och sällsynta (låg kondition) mikroorganismer. Dessutom är denna teknik lätt att anpassa till nästan alla organismer med kromosomer som kan modifiering, samt till olika experimentella konstruktioner som kräver absolut kvantifiering av mikroorganismer.
Introduction
Att bedöma patogena organismers kondition och virulens är en grundläggande aspekt av mikrobiologi. Det gör det möjligt att göra jämförelser mellan stammar eller mellan muterade organismer, vilket gör det möjligt för forskarna att bestämma betydelsen av vissa gener under särskilda förhållanden. Traditionellt, virulens bedömning använder en djurmodell av infektion med hjälp av olika bakteriestammar och observera resultatet av det infekterade djuret (t. ex. infektiös dos50, dödlig dos50, tid till döden, symtomens svårighetsgrad, brist på symtom, etc.). Detta förfarande ger värdefulla beskrivningar av virulens, men det kräver stammar att orsaka betydande skillnader i utfall för att upptäcka variationer från vildtyp. Dessutom, resultaten är semi-kvantitativa eftersom medan sjukdomsprogression och symtom svårighetsgrad kan subjektivt kvantifieras över tiden, tolkning av virulens jämfört med vildtyp är mer kvalitativ (dvs. mer, mindre eller lika virulent). Ett vanligt alternativ till att utföra djur smittsamhet är att generera konkurrens index (CIs), värden som direkt jämför kondition eller virulens av en stam till en vild typ motsvarighet i en blandad infektion1. Denna teknik har många fördelar jämfört med en traditionell djurmodell av infektion genom att standardisera virulens till en vild typ stam och fastställa ett kvantifierbara värde för att återspegla graden av dämpning. Denna teknik kan också anpassas för att analysera geninteraktioner hos bakterier genom att fastställa ett avbrutet konkurrens index (COI)2. Vid beräkning av en COI för en grupp muterade organismer kan forskarna avgöra om två gener självständigt bidrar till patogenesen eller om de är involverade i samma virulensväg och är beroende av varandra. Dessutom kräver beräkning av en CI uppräkning av bakterier som kan ge värdefulla insikter i patogenesen av organismer. CIs och COIs gör det också möjligt för forskare att bedöma Avirulenta stammar som inte orsakar klinisk sjukdom men fortfarande har skillnader i kondition. Denna teknik begränsas av användningen av traditionella antibiotikaresistens markörer för att identifiera stammar, vilket begränsar antalet ingångs stammar till endast en eller två i taget. På grund av denna begränsning, krävs ett stort antal experimentella grupper och replikat, som förutom att lägga till arbets-och materialkostnader, också ökar möjligheterna till variation i experimentella förhållanden och felaktiga resultat. (För en grundlig genomgång av nyttan och tillämpningarna av att använda blandade infektioner för att studera virulens, kondition och geninteraktioner, se C.R. Beuzón och D.W. Holden 1)
Försök har gjorts för att övervinna denna begränsning, såsom användning av fluorescerande-märkta celler kvantifieras via flödescytometri3,4,5. Denna teknik kvantifierar celler med antingen 1) märkt antikroppar mot fenotypiska markörer eller 2) endogent producerade fluorescerande proteiner. Användningen av märkta antikroppar har en detektionsgräns på 1 000 celler/mL, och kräver därför ett stort antal celler för att analysera3. Celler som uttrycker fluorescerande proteiner har en förändrad fysiologi och är mottagliga för konditions förändringar till följd av högt proteinuttryck6. Båda metoderna är begränsade av antalet fluorescerande markörer detekterbara med flödescytometri. En avancemang i molekylär kvantifiering uppnåddes genom utveckling av en microarray teknik som detekterade dämpning i 120 stammar från en initial blandad infektion av över 1 000 stammar i en murin modell7. Denna teknik utnyttjade en Microarray analys av RNA från muterade stammar, vilket leder till betydande variation i resultatet. Det fastställdes dock att stora pooler av blandade infektioner kan vara ett användbart verktyg och att genom att använda känsliga detektionstekniker kan skillnader i bakteriell virulens identifieras. Med utvecklingen av nästa generations sekvensering utvidgade TN-SEQ nyttan av transposon mutationer, vilket möjliggjorde en kraftfull metod för att kvantifiera bakterier som var slumpmässigt muterade8,9,10, 11. Ett alternativt protokoll utvecklades nyligen som eliminerar behovet av transposoner och i stället använder DNA-streckkoder för att lättare identifiera och spåra genomiska förändringar och deras inverkan på Fitness12. Denna teknik är en stor avancemang, men införandet av genomiska streckkoder är fortfarande en slumpmässig process. För att övervinna slumpmässighet av tidigare experiment, Yoon et al. utvecklat en metod för att beräkna CIs av salmonella stammar med hjälp av unika DNA-streckkoder införas på exakta platser på kromosomerna av bakterier13. Unika barkodade stammar upptäcktes med hjälp av en qPCR-baserad metod med SYBR Green och primers som är specifika för varje unik streckkod. Tekniken begränsades av restriktioner som införts av qPCR, inklusive skillnader i primer effektivitetsvinster och låg känslighet, vilket framgår av behovet av kapslade-PCR före qPCR. Detta tillvägagångssätt visade dock att riktade genomiska modifikationer skulle kunna utnyttjas för att upptäcka och potentiellt kvantifiera pooler av flera bakteriestammar.
I följande protokoll beskriver vi en ny metod för att utföra bakteriella konkurrens experiment med stora pooler av blandade inokulat följt av noggrann kvantifiering med hjälp av en mycket känslig Digital PCR-teknik. Protokollet innebär genetiskt märkning bakteriestammar med en unik DNA-streckkod införas på en ofarlig region av kromosomen. Denna modifiering gör att stammar snabbt och korrekt kvantifieras med hjälp av modern molekylär teknik i stället för traditionella seriella utspädningar, replika plätering, och räkna Colony Forming enheter som förlitar sig på fenotypiska markörer (dvs. antibiotikaresistens ). Modifieringarna möjliggör samtidig bedömning av många stammar i en enda poolade inoculum, avsevärt minska risken för experimentell variation eftersom alla stammar utsätts för exakt samma villkor. Dessutom, medan denna teknik utvecklades i salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium, det är mycket anpassningsbar till någon genetiskt aducerade organism och nästan alla experimentella design där exakta bakterie värden krävs, vilket ger en ny verktyg för att öka noggrannheten och genomströmningen i mikrobiologi laboratorier utan de begränsningar som införts av tidigare metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förmågan att korrekt kvantifiera mikroorganismer är av största vikt för mikrobiologi forskning, och förmågan att räkna upp unika stammar från en initial blandad population har visat sig vara ett ovärderligt verktyg för att bedöma fitness och virulens egenskaper i Bakterier. Men teknikerna för att åstadkomma detta har inte utvecklats i takt med den moderna utvecklingen inom molekylärbiologi. Tekniken för att enkelt modifiera kromosomerna hos många bakterier, inklusive S. Typhimurium, har varit ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av George F. Haddix presidentens forskningsfond och National Institute of General Medical Science vid National Institutes of Health (NIH) under tilldelnings nummer GM103427. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som finns hos National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O’Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
