यह लेख कक्षीय लैक्रिमल ग्रंथि प्रणाली के सभी भागों में कॉन्सेवलिन ए इंजेक्शन द्वारा खरगोशों में तीव्र या पुरानी शुष्क नेत्र रोग को प्रेरित करने के लिए एक विधि के विकास का वर्णन करता है। यह विधि, पहले से रिपोर्ट किए गए लोगों से बेहतर है, औषधीय एजेंटों के अध्ययन के लिए उपयुक्त सूखी आंखों का एक प्रजनन योग्य, स्थिर मॉडल उत्पन्न करती है।
शुष्क नेत्र रोग (DED), नेत्र सतह की एक बहुकारक भड़काऊ बीमारी, जीवन की गुणवत्ता और स्वास्थ्य देखभाल लागत के लिए चौंका देने वाला निहितार्थ के साथ दुनिया भर में 6 मनुष्यों में 1 को प्रभावित करता है । जानकारीपूर्ण पशु मॉडल की कमी है कि अपनी प्रमुख सुविधाओं को संक्षिप्त DED के लिए नए चिकित्सीय एजेंटों के लिए खोज में बाधा डालता है । उपलब्ध डीईडी पशु मॉडल में सीमित प्रजनन क्षमता और प्रभावकारिता है। यहां एक मॉडल प्रस्तुत किया गया है जिसमें डीईडी को खरगोशों की कक्षीय लैक्रिमल ग्रंथियों में माइटोजेन कॉन्सवीन ए (कॉन ए) इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया जाता है। इस मॉडल के अभिनव पहलू अल्ट्रासाउंड (यूएस) मार्गदर्शन का उपयोग कर रहे हैं ताकि ईकॉन ए के इष्टतम और प्रजनन योग्य इंजेक्शन को अवर लैक्रिमल ग्रंथि में सुनिश्चित किया जा सके; सभी कक्षीय लैक्रिमल ग्रंथियों में कांग्रेस ए का इंजेक्शन जो आंसुओं के प्रतिपूरक उत्पादन को सीमित करता है; और कांग्रेस ए के आवधिक दोहराने इंजेक्शन का उपयोग करें जो डीईडी की स्थिति को लम्बा करदेगा। डीईडी और परीक्षण एजेंटों के प्रति इसकी प्रतिक्रिया पर उन मापदंडों के एक पैनल के साथ नजर रखी जाती है जो आंसू उत्पादन, आंसू फिल्म की स्थिरता और कॉर्नियल और कंजक्टिव म्यूकोसा की स्थिति का आकलन करते हैं। इनमें आंसू ऑस्मोलैरिटी, आंसू तोड़ने का समय, Schirmer के आंसू परीक्षण, गुलाब बंगाल धुंधला, और आंसू लैक्टोफेरिन का स्तर शामिल हैं । डीईडी को शामिल करने और उसके मापदंडों की निगरानी में विस्तार से बताया गया है। यह मॉडल सरल, मजबूत, प्रजनन योग्य और जानकारीपूर्ण है। यह पशु मॉडल आंसू शरीर विज्ञान और डीडी के रोगविज्ञान के अध्ययन के साथ-साथ डीडीडी के उपचार के लिए उम्मीदवार एजेंटों की प्रभावकारिता और सुरक्षा के आकलन के लिए उपयुक्त है।
शुष्क नेत्र रोग (डीईडी) उच्च व्यापकता और रुग्णता1,2,3,4के साथ एक पुरानी स्थिति है । सूजन इसके रोगजनक5,6में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है . डीईडी के रोगविज्ञान को या तो कम उत्पादन या आंसुओं के अधिक वाष्पीकरण से प्राप्त होने के रूप में संकल्पित किया जाता है; पूर्व भी जलीय कमी DED7के रूप में जाना जाता है . Sjögren सिंड्रोम, डीईडी के एक बड़े पैमाने पर अध्ययन किए गए प्रोटोटाइप कारण, मुख्य रूप से लैक्रिमल ग्रंथियों (एलजी) को प्रभावित करता है और डीईडी के रोगजनकता में उनके महत्व का एक उल्लेखनीय उदाहरण है। डीईडी को अक्सर कृत्रिम आंसुओं के साथ इलाज किया जाता है जो अस्थायी राहत प्रदान करते हैं, या साइक्लोस्पोरिन या लिफिटेग्रास्ट के साथ, दोनों जो नेत्र सूजन को दबाते हैं। डीईडी के लिए उपलब्ध उपचारों में से कोई भी इष्टतम नहीं है, जिससे नए एजेंटों के विकास की आवश्यकताहै8,9।
DED के लिए नए चिकित्सीय एजेंटों की खोज तीन प्रमुख चुनौतियों से बाधित होती है: एक मान्यता प्राप्त दवा देने योग्य आणविक लक्ष्य की कमी, जो डीईडी की रोगविज्ञानी जटिलता को देखते हुए मायावी हो सकती है; होनहार एजेंटों की विरलता; और पशु मॉडल की कमी जो डीडी की प्रमुख विशेषताओं को संक्षिप्त करता है।
अधिकांश दवा विकास प्रयासों के साथ, डीईडी के सूचनात्मक पशु मॉडल एक महत्वपूर्ण खोजी उपकरण हैं, इसके बावजूद कि कोई भी पशु मॉडल पूरी तरह से मानव रोग को फिर से तैयार नहीं करता है। DED के माउस, चूहा और खरगोश मॉडल का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है जबकि कुत्तों और वानरों का उपयोग कभी-कभी10,11किया जाता है। 12 से अधिक खरगोश डीडी मॉडलों ने आज तक एलजी को हटाकर या उनके कार्य को बाधित करके12,13,14 ,15,16को आंसू उत्पादन कम करने का प्रयास किया . इस तरह के दृष्टिकोण ों में आईएलजी का सर्जिकल रिसेक्शन शामिल है; इसके मलन वाहिनी को बंद करना; और निम्नलिखित में से एक के विकिरण या इंजेक्शन द्वारा एलजी कार्य को ख़राब करना: सक्रिय लिम्फोसाइट्स, माइटोजेन्स, बोटुलिनम टॉक्सिन, एट्रोपाइन, या बेंजलक्लाकोनियम। इन तरीकों की प्रमुख सीमाएं उनकी असंगतता और आंसू उत्पादन के लगातार आंशिक दमन हैं ।
Concanavalin ए (कांग्रेस ए), संयंत्र मूल का एक व्याख्यान, एक शक्तिशाली उत्तेजक टी सेल सबसेट है और हेपेटाइटिस17 और DED18के प्रयोगात्मक मॉडल में इस्तेमाल किया गया है । मूल कांग्रेस ए आधारित मॉडल को अपनी सापेक्ष सादगी सहित महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करने की सूचना दी गई थी; एलजी में भड़काऊ सेल प्रवाह, Sjogren जैसे रोगों की नकल उतार; भड़काऊ साइटोकिन्स आईएल-1ए, आईएल-8 और टीजीएफ-ए1 की उत्तेजना; आंसू फ्लोरेसिन क्लीयरेंस और आंसू ब्रेक-अप समय (TBUT) को मापने के द्वारा निगरानी किए गए आंसू समारोह; और एक विरोधी भड़काऊ कोर्टिकोस्टेरॉयड के लिए दिखाया गया दवा जवाबदेही।
जब इस आशाजनक विधि लागू किया गया था, इसके लाभ के अलावा, सीमाओं की पहचान की है कि अपने समग्र संशोधन और कठोर सुधार की आवश्यकता थी । विधि की तीन महत्वपूर्ण कमियों का दस्तावेजीकरण किया जाता है। सबसे पहले, मॉडल एक तीव्र था; प्रेरित DED के बारे में 1 सप्ताह के बाद थम गया । दूसरा, जानवरों की प्रतिक्रिया असंगत थी । के रूप में प्रदर्शन किया, अवर एलजी (ILG) के लिए “अंधा” ट्रांसक्यूटेरस इंजेक्शन में, कांग्रेस एक लक्षित ग्रंथि के लिए केवल बेतरतीब ढंग से दिया गया था । ILG के शरीर रचना विज्ञान के विस्तृत अध्ययन से पता चला है कि इसके आकार के रूप में ज्यादा के रूप में 4 गुना19 इस तरह के इंजेक्शन “हिट या याद आती है” प्रयासों बनाने के रूप में भिंन हो सकता है । अंत में, यहां तक कि जब ILG इंजेक्शन था, बेहतर एलजी (SLG) अक्सर कम आंसू प्रवाह के लिए मुआवजा, मॉडल समस्याग्रस्त बना रही है ।
इन प्रमुख सीमाओं को विधि में तीन संशोधनों को पेश करके दूर किया गया था, जो डीईडी का एक बेहतर पशु मॉडल पैदा कर रहा था। सबसे पहले, ILG में कांग्रेस ए के इंजेक्शन अल्ट्रासाउंड (अमेरिका) मार्गदर्शन के तहत किया गया था, यह सुनिश्चित करना है कि कांग्रेस एक ग्रंथि में प्रवेश किया । इंजेक्शन की सफलता के बाद एक इंजेक्शन अमेरिकी छवि प्राप्त करके पुष्टि की थी, जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है। दूसरा, SLG के प्रतिपूरक आंसू योगदान को दूर करने के लिए, इस ग्रंथि के दोनों पालेब्रल और कक्षीय भागों कांग्रेस ए के साथ इंजेक्शन थे । अंत में, DED के इस तीव्र मॉडल को हर 7-10 दिनों में कॉन ए के बार-बार इंजेक्शन द्वारा एक पुरानी में परिवर्तित कर दिया गया था। इन खरगोशों में 2 महीने की अवधि का डीडी आसानी से प्राप्त होता है। इस दृष्टिकोण की सफलता का दस्तावेजीकरण19किया गया है .
जैसा कि पहले ही उल्लेख किया गया है, डीईडी के पशु मॉडलका एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता और सुरक्षा का निर्धारण करना है। इस मॉडल की उपयोगिता फॉस्फोसुलिंडाक (OXT-328), एक उपन्यास विरोधी भड़काऊ छोटे अणु20,21 आंख की बूंदों के रूप में प्रशासित के अध्ययन से प्रदर्शित किया गया था। इसकी प्रभावकारिता को डीईडी19के मापदंडों के एक पैनल के आधार पर प्रदर्शित किया गया था । इस मॉडल की सापेक्ष सादगी और जानकारीपूर्ण प्रकृति ने अपनी मजबूत प्रीक्लिनिकल श्रेष्ठता का प्रदर्शन करते हुए डीईडी, साइक्लोस्पोरिन और लिफिटेग्रास्ट के लिए दो एफडीए अनुमोदित दवाओं को फॉस्फोसुलिंडाक की साइड-बाय-साइड तुलना की अनुमति दी।
DED के अध्ययन के लिए खरगोश बेहद आकर्षक हैं। उनके कॉर्निया और कंजक्टिवा में चूहों और चूहों की तुलना में मनुष्यों के करीब एक सतह क्षेत्र होता है; एस्टरासेस जैसे ड्रग मेटाबोलाइजिंग एंजाइमों का उनका पूरक, और उनकी लैक्रिमल ग्रंथियों का हिस्टोरोलॉजी मनुष्यों के समान है, और उनकी आंखें सूचनात्मक फार्माकोकाइनेटिक अध्ययनों के लिए काफी बड़ी हैं। सूअरों और बंदरों की तुलना में, जिसके साथ वे इसी तरह की विशेषताओं को साझा करते हैं, वे कम लागत और उनके प्रयोगात्मक हेरफेर आसान है । यदि मशीनी अध्ययनों पर विचार किया जाता है, तो चूहों की तुलना में खरगोश की एक सापेक्ष खामी यह है कि कम अभिकर्मक (जैसे, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) उपलब्ध हैं। दूसरी ओर, खरगोश फार्माकोकाइनेटिक और बायोडिस्ट्रीब्यूशन अध्ययनों के लिए चूहों से कहीं बेहतर है क्योंकि व्यक्तिगत ऊतकआसानी से विच्छेदित होते हैं और विश्लेषणात्मक कार्य के लिए पर्याप्त आकार के होते हैं, “नमूना पूलिंग” से बचते हैं।
एक महत्वपूर्ण सामान्य पैरामीटर खरगोशों की अनुकूलन अवधि है। जानवरों को उन परिस्थितियों में विक्रेता से भेज दिया जाता है जो अक्सर उचित तापमान या आर्द्रता के परिवहन वातावरण को सुनिश्चित नहीं करते हैं। हो सकता है कि कुछ जानवरों ने आगमन पर पहले से ही सूखी आंख विकसित कर ली हो। अनुकूलन की दो सप्ताह की अवधि की सिफारिश की जाती है। समान रूप से महत्वपूर्ण आर्द्रता और अंतरिक्ष के तापमान पर ईमानदार ध्यान है जहां अध्ययन खरगोशों vivarium में रखे जाते हैं । किसी भी स्थिति में विचलन उनकी आंख की स्थिति में भारी बदलाव को प्रेरित कर सकता है। हाथ पर बैक-अप ह्यूमिडिफायर्स और डिह्यूमिडिफायर्स हैं। यदि केंद्रीय प्रणाली विफल हो जाती है, तो बैक-अप उपकरणों का उपयोग करके परिवेश आर्द्रता को बहाल करने के लिए जल्दी से कार्य करें। ध्यान रखें कि गर्मी के महीनों में इस तरह के दुर्भाग्यपूर्ण घटनाएं अधिक आम हैं। हालांकि, खरगोशों में डीईडी को सफलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए तीन सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) आईएलजी की पहचान करने और कॉन ए के इंजेक्शन को निर्देशित और पुष्टि करने के लिए यूएस इमेजिंग का कुशल उपयोग; 2) दोनों ILG और SLG के दो भागों के इंजेक्शन सुनिश्चित करने; और 3) मज़बूती से और पुन: उत्पादन DED के मापदंडों परसते हैं।
आवश्यक प्रायोगिक कौशल का विकास तुच्छ नहीं है, लेकिन किसी भी गंभीर अन्वेषक को रोकते नहीं होना चाहिए । उम्मीद है कि सीखने की अवस्था पांच पुनरावृत्तियों के भीतर पूरी हो जाएगी। उचित गुणवत्ता की एक अमेरिकी इमेजिंग प्रणाली आवश्यक है। अमेरिका द्वारा शारीरिक पहचान की मान्यता महत्वपूर्ण है, इसलिए, अन्वेषक को खरगोश शरीर रचना विज्ञान की समीक्षा करनी चाहिए। डेविस25,एक क्लासिक द्वारा खरगोश शरीर रचना विज्ञान का उत्कृष्ट वर्णन, बेहद उपयोगी हो सकता है । इसके अलावा आईएलजी के आकार में भिन्नता को भी ध्यान में रखें। इस के लिए परिणाम यह है कि कांग्रेस की सफलता एक हमेशा इमेजिंग का पालन के साथ पुष्टि की जानी चाहिए । खरगोशों के एक समूह में कॉन ए की प्रतिक्रिया में भिन्नता अक्सर इंजेक्शन तकनीक (असफल या आंशिक रूप से सफल इंजेक्शन) के कारण होती है या आंसुओं के अधिक उत्पादन के साथ क्षतिपूर्ति करने के लिए अवशिष्ट लैक्रिमल ग्रंथि ऊतकों की क्षमता की अनदेखी करती है। जो लोग इंजेक्शन तकनीक में महारत हासिल करना चाहते हैं, उनके लिए मेथिलीन ब्लू को इंजेक्ट करना जिसके बाद त्वरित शारीरिक विच्छेदन मददगार हो सकता है; यदि यह लैक्रिमल ग्रंथि तक पहुंचता है या पड़ोसी ऊतकों पर फैल जाता है तो दृश्य प्राप्त होता है। आज तक, इस इंजेक्शन विधि को लेखकों द्वारा एक भी जटिलता के बिना 270 से अधिक बार किया गया है।
ऊपर प्रस्तुत DED के पांच मापदंडों को कहना उतना ही मुश्किल हो सकता है जितना कि नैदानिक अभ्यास में उनका दृढ़ संकल्प है। यद्यपि सर्कैडियन विविधताओं को अभी तक औपचारिक रूप से उनमें से किसी में प्रलेखित नहीं किया गया है, लेकिन आंख28 में ऐसी घटनाओं के पर्याप्त पृष्ठभूमि सबूत हैं कि उन्हें दिन के एक ही समय (± 1 एच) पर परख दिया जाना चाहिए, खासकर जब दोहराने वाले परखों को प्रदर्शन किया जाना है और एक दूसरे की तुलना में। इन परखों के प्रदर्शन में निरंतरता जरूरी है। दो की टीम की जरूरत है। एक ही कमरे में चार या अधिक जांचकर्ताओं परखों में भाग लेने के विघटनकारी हो सकता है, यह देखते हुए कि कुछ कदम सख्त समय की आवश्यकता है । उपयुक्त और उच्च गुणवत्ता वाले फोटोग्राफिक दस्तावेज, जहां इंगित किया गया है, महत्वपूर्ण है।
यह मॉडल आदर्श रूप से दवा विकास अध्ययन के लिए अनुकूल है। पशु मॉडल और परख तकनीकों की महारत प्रभावकारिता और सुरक्षा अध्ययन के उत्कृष्ट प्रजननक्षमता 19 सुनिश्चित की ।
यह एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है क्योंकि यह पूर्व मॉडलों की भ्रामक परिवर्तनशीलता को समाप्त करता है, पशु मॉडल को सुव्यवस्थित किया है और अनिवार्य रूप से डीईडी के पांच मापदंडों को परसने के लिए मानकीकृत है। एक उम्मीदवार चिकित्सकीय एजेंट के अध्ययन के लिए इस मॉडल के सफल आवेदन उपन्यास एजेंटों की हताश जरूरत में एक रोग के लिए एक जानकारीपूर्ण पशु मॉडल के रूप में अपनी व्यावहारिक उपयोगिता की पुष्टि की है और इसके रोगजनकता की गहरी समझ की ।
The authors have nothing to disclose.
सभी प्रासंगिक नियामक और संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार और अनुपालन के अनुसार सभी पशु अध्ययन पूरे किए गए । सभी अध्ययनों को पथरीले ब्रूक विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए ARVO बयान के अनुसार प्रदर्शन किया गया था ।
इन अध्ययनों को पथरीले ब्रूक विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन (ग्रांट नंबर 1149271-1-82502) से एक लक्षित अनुसंधान अवसर अनुदान और मेडिसन फार्मास्यूटिकल्स, इंक, सेतुकेट, NY से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक संपादकीय समर्थन के लिए मिशेल मैकटर्नन का शुक्रिया अदा करते हैं ।
100 mm macro lens | Canon EF 100mm f/2.8L IS USM | 3554B002 | |
26 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305115 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
27 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305921 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
Aceproinj (acepromazine) | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation |
Anesthesia vaporizer | VetEquip, Pleasanton, CA | Item #911103 | |
Bishop Harmon Forceps | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Tissue forceps |
Caliper | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E-2404 | Caliper used to measure length of needle during ConA injection |
Concanavalin A | Sigma, St. Louis, MO | C2010 | Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands |
DSLR camera | Canon EOS 7D DSLR | 3814B004 | Digital single lens reflex camera |
fluorescein | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT |
Isoflurane | Henry Schein, Melville, NY | 29405 | |
Lactoferrin ELISA kit | MyBiosource, San Diego, CA | MBS032049 | Measure tear lactoferrin level |
lidocaine | Sigma, St. Louis, MO | L5647 | 1% in PBS for anesthesia agent |
macro/ring flash | Canon Macro Ring Lite MR-14EXII | 9389B002AA | |
Osmolarity tips | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Measure tear osmolarity |
PBS (phosphate buffered saline) | Mediatech, Inc. Manassas, VA | 21-031-CV | |
Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text) | Charles River Labs, Waltham, MA | 2-3 kg | Research animals |
Rose Bengal | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% in PBS, stain the ocular surface |
Schirmer strips | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | Measure tear production |
Surgical Loupes +1.50 | Designs for Vision, Bohemia, NY | Specialty item | Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections. |
TearLab Osmometer | TearLab Corp., San Diego, CA | Model #200000W REV A | Measure tear osmolarity |
Ultrasound probe | VisualSonics Toronto, Ont | MX 550 S | Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland |