Denna artikel beskriver utvecklingen av en metod för att inducera akut eller kronisk torra ögon sjukdom hos kaniner genom att injicera concanavalin A till alla delar av orbital lacrimal körtel system. Denna metod, överlägsen dem som redan rapporterats, genererar en reproducerbar, stabil modell av torra ögon som lämpar sig för studier av farmakologiska medel.
Torrögonsjukdom (DED), en multifaktoriell inflammatorisk sjukdom i okulär yta, drabbar 1 av 6 människor över hela världen med häpnadsväckande konsekvenser för livskvalitet och sjukvårdskostnader. Bristen på informativa djurmodeller som sammanfattar dess viktigaste funktioner hindrar sökandet efter nya terapeutiska medel för DED. Tillgängliga DED djurmodeller har begränsad reproducerbarhet och effekt. En modell presenteras här där DED induceras genom att injicera mitogen concanavalin A (Con A) i orbital lacrimal körtlar av kaniner. Innovativa aspekter av denna modell är användningen av ultraljud (US) vägledning för att säkerställa optimal och reproducerbar injektion av Con A i sämre lacrimal körtel; injektion av Con A i alla orbital lacrimal körtlar som begränsar kompensatorisk produktion av tårar; användning av periodiska upprepade injektioner av Con A som förlänger tillståndet för DED efter behag. DED och dess svar på testagenter övervakas med en panel av parametrar som bedömer tårproduktion, stabiliteten i tår filmen, och status hornhinnanoch konjunktival mukosa. De inkluderar tår osmolarity, riva break-up tid, Schirmer’s tear test, ros bengal färgning, och riva laktoferrin nivåer. Induktionen av DED och övervakningen av dess parametrar beskrivs i detalj. Denna modell är enkel, robust, reproducerbar och informativ. Denna djurmodell är lämplig för studier av tårfysiologi och patofysiologi av DED samt för bedömning av effekt och säkerhet för kandidatmedel för behandling av DED.
Torra ögonsjukdom (DED) är ett kroniskt tillstånd med hög prevalens och sjuklighet1,2,3,4. Inflammation spelar en nyckelroll i dess patogenes5,6. Pathophysiology av DED är conceptualized som härledas från endera under-produktion eller över-avdunstning av revor; den förstnämnda är också känd som vattenhaltig-bristfällig ad7. Sjögrens syndrom, en omfattande studerad prototypisk orsak till DED, påverkar främst lacrimal körtlar (LGs) och är ett slående exempel på deras betydelse för patogenesen vid DED. DED behandlas ofta med konstgjorda tårar som ger tillfällig lindring, eller med ciklosporin eller lifitegrast, som båda undertrycker okulär inflammation. Ingen av de tillgängliga behandlingarna för DED är optimala, vilket kräver utveckling av nya medel8,9.
Sökandet efter nya terapeutiska medel för DED hämmas av tre stora utmaningar: avsaknaden av ett erkänt druggable molekylärt mål, som kan vara svårfångade med tanke på den patofysiologiska komplexitetEN i DED; sparsiteten hos lovande medel. och bristen på djurmodeller som sammanfattar viktiga funktioner i DED.
Som med de flesta drogutvecklingsinsatser, informativa djurmodeller av DED är ett avgörande utredningsverktyg, trots det axiomatiska uttalandet att ingen djurmodell helt sammanfattar en mänsklig sjukdom. Mus, råtta och kanin modellerna av DED de/vi/du/ni är mest vanligen använd fördriva tiden hund och primater de/vi/du/ni är använd sällan10,11. De flesta av de mer än 12 kanin-DED-modeller som hittills rapporterats försöka minska tårproduktionen genom att antingen ta bort LGs eller genom att hindra deras funktion12,13,14,15,16. Sådana metoder inkluderar kirurgiska samband av ILG; stängning av dess utsöndringskanal. och försämraLG-funktionen genom bestrålning eller injektion av något av följande: aktiverade lymfocyter, mitogens, botulinumtoxin, atropin eller bensalklonium. Viktiga begränsningar av dessa metoder är deras inkonsekvens och frekventpartiell undertryckande av tårproduktion.
Concanavalin A (Con A), en lektin av vegetabiliskt ursprung, är en potent stimulator T-cells undergrupper och har använts i experimentella modeller av hepatit17 och DED18. Den ursprungliga Con A-baserade modellen rapporterades erbjuda betydande fördelar, inklusive dess relativa enkelhet; inflammatorisk celltillströmning i LGs, härma sjukdomar som Sjögrens; stimulering av de proinflammatoriska cytokinerna IL-1β, IL-8 och TGF-β1; nedsatt tårfunktion som övervakas genom mätning av tårfluoresceinclearance och rivupplösningstid (TBUT); och läkemedelslyhördhet som visas för en antiinflammatorisk kortikosteroid.
När denna lovande metod tillämpades identifierades, utöver dess fördelar, begränsningar som krävde dess övergripande revidering och drastiska förbättringar. Tre kritiska brister i metoden dokumenteras. För det första var modellen akut; den inducerade ded avtog efter ca 1 vecka. För det andra var djurens reaktion inkonsekvent. Som visat, i “blinda” transkutana injektioner till Inferior LG (ILG), Con A levererades endast slumpmässigt till den riktade körteln. Detaljerad studie av anatomi ILG visade att dess storlek kan variera så mycket som 4-faldigt19 gör sådana injektioner “hit-or-miss” insatser. Slutligen, även när ILG injicerades, kompenserade den överlägsna LG (SLG) ofta för det minskade tårflödet, vilket gör modellen problematisk.
Dessa viktiga begränsningar övervanns genom att införa tre ändringar av metoden, vilket genererar en överlägsen djurmodell av DED. Först utfördes injektionen av Con A i ILG under ultraljud (US) vägledning, se till att Con A in i körteln. Framgången för injektionen bekräftades genom att få en post-injektion amerikansk bild, som visas i figur 1. För det andra, för att ta bort kompensatoriska tår bidrag SLG, både palpebral och orbital delar av denna körtel injicerades med Con A. Slutligen konverterades denna akuta modell av DED till en kronisk genom upprepade injektioner av Con A var 7-10 dagar. DED av 2 månaders varaktighet uppnås lätt i dessa kaniner. Framgången för detta tillvägagångssätt har dokumenterats i hög tid19.
Som redan nämnts är en viktig tillämpning av djurmodeller av DED att bestämma effekten och säkerheten hos terapeutiska läkemedelsmedel från kandidaten. Nyttan av denna modell visades genom studiet av fosforsulindac (OXT-328), en ny antiinflammatorisk liten molekyl20,21 administreras som ögondroppar. Dess effekt visades baserat på en panel av parametrar för DED19. Den relativa enkelhet och informativ karaktär av denna modell tillät också sida vid sida jämförelse av fosforsulindac till de två FDA godkända läkemedel för DED, cyclosporine och lifitegrast, visar sin starka prekliniska överlägsenhet.
Kaniner är mycket attraktiva för studier av DED. Deras hornhinna och bindhinna har en yta närmare människor jämfört med möss och råttor; deras komplement av läkemedelsmetaboliserande enzymer såsom esterass, och histologi av deras lacrimal körtlar liknar dem hos människor, och deras ögon är tillräckligt stora för informativa farmakokinetiska studier. Jämfört med grisar och apor, som de delar liknande funktioner, de kostar mindre och deras experimentella manipulation är lättare. Om mekanistiska studier övervägs, en relativ nackdel med kaninen, jämfört med möss, är att färre reagenser (t.ex. monoklonala antikroppar) finns tillgängliga. Å andra sidan är kaninen vida överlägsen möss för farmakokinetiska studier och biodistributionstudier eftersom enskilda vävnader lätt dissekeras och av tillräcklig storlek för analytiskt arbete, undvika “provpoolning.”Å andra sidan är kaninen vida överlägsen möss för farmakokinetiska studier och biodistributionstudier eftersom enskilda vävnader lätt dissekeras och av tillräcklig storlek för analytiskt arbete, undvika “provpoolning”.
En kritisk allmän parameter är kaninernas acklimatiseringsperiod. Djuren transporteras från säljaren under förhållanden som ofta inte garanterar en transportmiljö av lämplig temperatur eller luftfuktighet. Vissa djur kan redan ha utvecklat torra ögon vid ankomsten. En tvåveckorsperiod av acklimatisering rekommenderas. Lika viktigt är noggrann uppmärksamhet på luftfuktigheten och temperaturen i det utrymme där studien kaniner är inrymt i vivarium. Avvikelser i båda villkoren kan framkalla stora variationer i deras ögonstatus. Ha back-up luftfuktare och avfuktare till hands. Om det centrala systemet misslyckas, agera snabbt för att återställa omgivningsluftfuktigheten med hjälp av back-up-utrustningen. Tänk på att en sådan olycklig utveckling är vanligare under sommarmånaderna. De tre mest kritiska stegen, dock för att framgångsrikt förmå DED hos kaniner är: 1) den skickliga användningen av amerikansk bildbehandling för att identifiera ILG och att direkt och bekräfta injektion av Con A; 2) säkerställa injektion av både ILG och de två delarna av SLG; och 3) tillförlitligt och reproducerbart som säger parametrarna för DED.
Att utveckla den experimentella skicklighet som krävs är inte trivialt, men bör inte avskräcka någon seriös utredare. Förvänta dig att inlärningskurvan ska slutföras inom fem iterationer. Ett amerikanskt bildsystem av rimlig kvalitet är viktigt. Erkännande av anatomiska kännetecken av USA är viktigt, därför bör utredaren granska kaninanatomin. Den utmärktbeskrivning av kanin anatomi av Davis25, en klassiker, kan vara oerhört hjälpsam. Tänk också på variationen i storleken på ILG. Följden av detta är att framgången för Con A alltid måste bekräftas med uppföljning imaging. Variationer i svaret på Con A i en grupp kaniner beror oftast på injektionstekniken (misslyckad eller delvis lyckad injektion) eller att ignorera kapaciteten hos kvarvarande lacrimalkörtelvävnader för att kompensera med överproduktion av tårar. För dem som vill behärska injektionstekniken kan injektionsmetylenblått följt av snabb anatomisk dissekering vara till hjälp; visualisering uppnås om den når lacrimal körtel eller spill på angränsande vävnader. Hittills har denna injektionsmetod utförts över 270 gånger av författarna utan en enda komplikation.
Assaying de fem parametrarna för DED presenteras ovan kan vara så knepigt som är deras bestämning i klinisk praxis. Även om dygnsrytmvariationer ännu inte formellt har dokumenterats i någon av dem, finns det tillräckligt med bakgrundsbevis för sådana fenomen i ögat28 att de bör analyseras samtidigt på dagen (± 1 h), särskilt när upprepade analyser ska utföras och jämföras med varandra. Konsekvens i att utföra dessa analyser är viktigt. Ett team på två krävs. Fyra eller fler utredare i samma rum som deltar i uppsatserna kan vara störande, med tanke på att vissa steg kräver strikt timing. Lämplig och högkvalitativ fotografisk dokumentation, om så anges, är viktig.
Denna modell är idealisk för läkemedelsutveckling studier. Behärskning av djurmodell och analystekniker säkerställde utmärkt reproducerbarhet19 av effekt- och säkerhetsstudier.
Detta är en kraftfull experimentell strategi eftersom det eliminerar förvirrande variationer av tidigare modeller, har effektiviserat djurmodellen och i huvudsak standardiserad assaying de fem parametrarna för DED. Den framgångsrika tillämpningen av denna modell till studiet av en kandidat terapeutiskagent har bekräftat sin praktiska nytta som en informativ djurmodell för en sjukdom i desperat behov av nya agenter och en djupare förståelse av dess patogenes.
The authors have nothing to disclose.
Alla djurstudier slutfördes i enlighet med och efterlevnaden av alla relevanta rättsliga och institutionella riktlinjer. Alla studier godkändes av Institutional Review Board of Stony Brook University och utfördes i enlighet med ARVO uttalande för användning av djur i oftalmisk och vision forskning.
Dessa studier stöddes delvis av en riktad forskningsmöjligheter bidrag från Stony Brook University School of Medicine (Grant Number 1149271-1-82502) och ett forskningsanslag från Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Författarna tackar Michele McTernan för redaktionellt stöd.
100 mm macro lens | Canon EF 100mm f/2.8L IS USM | 3554B002 | |
26 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305115 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
27 gauge needles (5/8) | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305921 | Needles for injecting ConA into the lacrimal glands |
Aceproinj (acepromazine) | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation |
Anesthesia vaporizer | VetEquip, Pleasanton, CA | Item #911103 | |
Bishop Harmon Forceps | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Tissue forceps |
Caliper | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E-2404 | Caliper used to measure length of needle during ConA injection |
Concanavalin A | Sigma, St. Louis, MO | C2010 | Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands |
DSLR camera | Canon EOS 7D DSLR | 3814B004 | Digital single lens reflex camera |
fluorescein | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT |
Isoflurane | Henry Schein, Melville, NY | 29405 | |
Lactoferrin ELISA kit | MyBiosource, San Diego, CA | MBS032049 | Measure tear lactoferrin level |
lidocaine | Sigma, St. Louis, MO | L5647 | 1% in PBS for anesthesia agent |
macro/ring flash | Canon Macro Ring Lite MR-14EXII | 9389B002AA | |
Osmolarity tips | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Measure tear osmolarity |
PBS (phosphate buffered saline) | Mediatech, Inc. Manassas, VA | 21-031-CV | |
Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text) | Charles River Labs, Waltham, MA | 2-3 kg | Research animals |
Rose Bengal | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% in PBS, stain the ocular surface |
Schirmer strips | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | Measure tear production |
Surgical Loupes +1.50 | Designs for Vision, Bohemia, NY | Specialty item | Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections. |
TearLab Osmometer | TearLab Corp., San Diego, CA | Model #200000W REV A | Measure tear osmolarity |
Ultrasound probe | VisualSonics Toronto, Ont | MX 550 S | Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland |