بناء من CRISPR Plasmids والكشف عن كفاءة خروج المغلوب في خلايا الثدييات من خلال نظام مراسل Luciferase مزدوجة
Summary
هنا، نقدم بروتوكول يصف طريقة مبسطة لتوليد كفاءة البلازميدات التعبير عن كل من الانزيم CRISPR ودليل واحد المرتبطة RNA (sgRNAs). co-transfection من خلايا الثدييات مع هذا الناقل sgRNA / CRISPR وseiferase مزدوجة لوسيفيراز مراسل الناقل الذي يدرس مزدوجة حبلا كسر إصلاح يسمح بتقييم كفاءة خروج المغلوب.
Abstract
على الرغم من كفاءة عالية، تعديل موقع الجينوم من قبل انزيم CRISPR يتطلب توليد sgRNA فريدة من نوعها إلى الموقع المستهدف (المواقع) مسبقا. يصف هذا العمل الخطوات الرئيسية التي تؤدي إلى بناء ناقلات SgRNA فعالة باستخدام استراتيجية تسمح بالكشف الفعال للمستعمرات الإيجابية بواسطة PCR قبل تسلسل الحمض النووي. وبما أن تحرير الجينوم الفعال باستخدام نظام CRISPR يتطلب SgRNA عالية الكفاءة ، فإن الاختيار المسبق لأهداف SgRNA المرشحة ضروري لتوفير الوقت والجهد. وقد تم تطوير نظام مراسل luciferase مزدوجة لتقييم كفاءة خروج المغلوب من خلال دراسة إصلاح كسر حبلا مزدوجة عن طريق حبلا وحيد. هنا ، نستخدم نظام المراسل هذا لالتقاط الهدف المفضل xCas9/sgRNA من ناقلات sgRNA المرشحة لتحرير جينات محددة. وسيوفر البروتوكول المبين ناقل إنزيم SgRNA/CRISPR المفضل في 10 أيام (بدءًا من oligonucleotides المصمم بشكل مناسب).
Introduction
و CRISPR sgRNAs تضم تسلسل 20-النيوكليوتيدات (بروتوسبر), وهو مكمل لتسلسل الهدف الجينومي1,2. على الرغم من كفاءة عالية، فإن قدرة نظام CRISPR/Cas على تعديل موقع الجينوم معين يتطلب توليد ناقل يحمل sgRNA كفاءة فريدة من نوعها إلى الموقع المستهدف (ق)2. هذه الورقة تصف الخطوات الرئيسية في توليد هذا المتجه sgRNA.
لنجاح تحرير الجينوم باستخدام نظام CRISPR / Cas ، فإن استخدام sgRNAs عالية الكفاءة هو شرط أساسي حاسم3و4و5. منذ النوى المهندسة المستخدمة في تحرير الجينوم تظهر كفاءات متنوعة في مختلف loci المستهدفة1، واختيار مسبق من أهداف sgRNA مرشح ضروري من أجل توفير الوقت والجهد6،7،8،9. وقد تم تطوير نظام مراسل luciferase المزدوج لتقييم كفاءة خروج المغلوب من خلال دراسة إصلاح كسر حبلا مزدوجة عن طريق حبلا واحد التلاهم3,10. هنا نستخدم هذا النظام مراسل لاختيار هدف كريسبر SgRNA المفضل من مختلف ناقلات sgRNA مرشح مصممة لتحرير الجينات محددة. تم تنفيذ البروتوكول المذكور هنا في مجموعتنا والمختبرات المتعاونة على مدى السنوات القليلة الماضية لتوليد وتقييم SgRNAs كريسبر.
يلخص البروتوكول التالي كيفية تصميم sgRNA مناسبة من خلال برامج الشبكة. بمجرد تحديد sgRNAs مناسبة، ونحن وصف الخطوات المختلفة للحصول على oligonucleotides المطلوبة، فضلا عن نهج لإدراج oligonucleotides المقترنة في ناقلات التعبير pX330-xCas9. ونحن نقدم أيضا طريقة لتجميع sgRNA التعبير عن وseiferase مزدوجة ناقلات مراسل استنادا إلى ربط هذه التسلسلات في ناقلات التعبير قبل هضم (الخطوات 2-10، الشكل 1A). وأخيراً، فإننا نُصف كيفية تحليل كفاءة قطع الحمض النووي لكل من الـ sgRNAs (الخطوات 11-12).
Protocol
Representative Results
Discussion
إجراءات استنساخ ناقلات sgRNA التي وصفناها هنا تسهل الإنتاج الفعال للـ sgRNAs ، مع معظم التكاليف المستمدة من طلب القلة وترتيب ناقلات. في حين أن الطريقة الموضحة مصممة للسماح للمستخدمين بتوليد sgRNAs للاستخدام مع CRISPR/Cas9 ، يمكن بسهولة تكييف البروتوكول للاستخدام مع تقويم Cas9 أو غيرها من عمليات الاستند?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا المشروع من قبل الدرجة الأولى برنامج العلوم في الأراضي العشبية من مقاطعة شاندونغ (الصين)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31301936، 31572383)، الصندوق الخاص للبحوث الزراعية العلمية في المصلحة العامة (201403071)، وتقييم المخاطر الوطنية المشروع الخاص الرئيسي لجودة وسلامة منتجات الحليب (GJFP201800804) ومشاريع تشينغداو سبل العيش للشعب العلم والتكنولوجيا (19-6-1-68-nsh، 14-2-3-45-nsh، 13-1-3-88-nsh).
Materials
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
- Li, K., et al. An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. , (2012).
- Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
- Li, H., et al. A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. , (2015).
