Bau von CRISPR Plasmiden und Nachweis von Knockout-Effizienz in Säugetierzellen durch ein Dual Luciferase Reporter System
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine optimierte Methode zur effizienten Erzeugung von Plasmiden beschreibt, die sowohl das CRISPR-Enzym als auch die zugehörige Single Guide RNA (sgRNAs) exemittiert. Die Kotransfektion von Säugetierzellen mit diesem sgRNA/CRISPR-Vektor und einem dualen Luziferase-Reportervektor, der die Reparatur von Doppelstrang-Bruch untersucht, ermöglicht die Bewertung der Knockout-Effizienz.
Abstract
Obwohl hocheffizient, erfordert die Modifikation einer genomischen Stelle durch das CRISPR-Enzym die Generierung einer sgRNA, die für die Zielstelle(en) im Voraus einzigartig ist. Diese Arbeit beschreibt die wichtigsten Schritte, die zum Aufbau effizienter sgRNA-Vektoren führen, mit einer Strategie, die eine effiziente Detektion der positiven Kolonien durch PCR vor der DNA-Sequenzierung ermöglicht. Da eine effiziente Genombearbeitung mit dem CRISPR-System eine hocheffiziente sgRNA erfordert, ist eine Vorauswahl von Kandidaten-sgRNA-Zielen notwendig, um Zeit und Aufwand zu sparen. Ein duales luziferase-Reportersystem wurde entwickelt, um die K.o.-Effizienz zu bewerten, indem die Reparatur von Doppelstrang-Pausen durch einstrangiges Glühen untersucht wird. Hier verwenden wir dieses Reportersystem, um das bevorzugte xCas9/sgRNA-Ziel von Kandidaten-sgRNA-Vektoren für eine spezifische Genbearbeitung abzuholen. Das skizzierte Protokoll wird einen bevorzugten sgRNA/CRISPR-Enzymvektor in 10 Tagen liefern (beginnend mit entsprechend entwickelten Oligonukleotiden).
Introduction
Die CRISPR sgRNAs bestehen aus einer 20-Nukleotid-Sequenz (dem Protospacer), die die genomische Zielsequenz1,2ergänzt. Obwohl hocheffizient, erfordert die Fähigkeit des CRISPR/Cas-Systems, eine bestimmte genomische Site zu modifizieren, die Erzeugung eines Vektors, der eine effiziente sgRNA trägt, die für die Zielsite(en)2einzigartig ist. In diesem Artikel werden die wichtigsten Schritte bei der Generierung dieses sgRNA-Vektors beschrieben.
Für eine erfolgreiche Genombearbeitung mit dem CRISPR/Cas-System ist der Einsatz hocheffizienter sgRNAs eine entscheidende Voraussetzung3,4,5. Da in der Genombearbeitung eingesetzte Nukleasen unterschiedliche Effizienzen an verschiedenen Ziel-Loci1aufweisen, ist eine Vorauswahl von Kandidaten-sgRNA-Zielen erforderlich, um Zeit und Aufwandzusparen 6,7,8,9. Ein duales luziferase Reportersystem wurde entwickelt, um die Knockout-Effizienz zu bewerten, indem die Reparatur von Doppelstrang-Pausen über einstrangiges Glühen3,10untersucht wird. Hier verwenden wir dieses Reportersystem, um ein bevorzugtes CRISPR sgRNA-Ziel aus verschiedenen Kandidaten-sgRNA-Vektoren auszuwählen, die für die spezifische Genbearbeitung entwickelt wurden. Das hier angegebene Protokoll wurde in den letzten Jahren in unserer Gruppe und in den Kooperierenden Laboratorien implementiert, um CRISPR sgRNAs zu generieren und zu bewerten.
Das folgende Protokoll fasst zusammen, wie geeignete sgRNA über Netzwerksoftware zu entwerfen. Sobald die geeigneten sgRNAs ausgewählt sind, beschreiben wir die verschiedenen Schritte, um die erforderlichen Oligonukleotide zu erhalten, sowie den Ansatz, die gepaarten Oligonukleotide in den pX330-xCas9-Expressionsvektor einzufügen. Wir präsentieren auch eine Methode zur Zusammenstellung von sgRNA-exezierenden und dualen Luziferase-Reportervektoren, die auf der Ligation dieser Sequenzen in einen vorverdauten Expressionsvektor basieren (Schritte 2-10, Abbildung 1A). Schließlich beschreiben wir, wie die DNA-Schneideffizienz für jeden der sgRNAs analysiert werden kann (Schritte 11-12).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die sgRNA-Vektorklonierungsverfahren, die wir hier beschrieben haben, erleichtern die effiziente Produktion von sgRNAs, wobei die meisten Kosten aus der Oligonukleotid-Reihenfolge und Vektorsequenzierung abgeleitet werden. Während die skizzierte Methode entwickelt wurde, um Benutzern die Generierung von sgRNAs für die Verwendung mit CRISPR/Cas9 zu ermöglichen, kann das Protokoll leicht für die Verwendung mit Cas9-Orthoologen oder anderen RNA-geführten Endonukleasen wie Cpf1 angepasst werden, wodurch kleinere Modifik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde durch das First Class Grassland Science Discipline Program der Provinz Shandong (China), die National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), der Sonderfonds für agrowissenschaftliche Forschung im öffentlichen Interesse (201403071), Nationale Risikobewertung großes Sonderprojekt für die Qualität und Sicherheit von Milcherzeugnissen (GJFP201800804) und Projekte der Qingdao People es Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
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