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方法文章

体外ELISA检测法评估狂犬病疫苗效价

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DOI：

10.3791/59641

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2020年5月11日

 , 
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

本文内容

摘要

本文介绍一种间接ELISA夹心免疫捕获法，用于测定狂犬病疫苗中免疫原性糖蛋白的含量。该检测方法采用一种可识别糖蛋白三聚体的中和性单克隆抗体（mAb-D1），可作为体内NIH试验的替代方法，用于在生产过程中监测疫苗效力的一致性。

摘要

全球对动物福利日益增长的关注正推动生产商和国家控制实验室（OMCLs）遵循“3R”原则，即替代、减少和优化实验动物的使用。世界卫生组织（WHO）和欧洲层面均推荐开发体外方法，作为评估狂犬病疫苗效力的NIH试验的替代方案。在狂犬病病毒（RABV）颗粒表面，糖蛋白的三聚体构成主要免疫原，可诱导产生病毒中和抗体（VNAbs）。目前已开发出一种ELISA检测方法，其中中和性单克隆抗体（mAb-D1）可特异性识别糖蛋白的三聚体形式，用于测定疫苗批次生产过程中天然折叠的三聚体糖蛋白含量。该体外效力检测方法与NIH试验具有良好的一致性，并已在狂犬病疫苗生产商和OMCLs的协作试验中被证明适用。避免使用动物是近期未来可实现的目标。

本方法基于一种间接ELISA夹心免疫捕获技术，使用单克隆抗体D1（mAb-D1）识别三聚体狂犬病病毒（RABV）糖蛋白的抗原位点III（氨基酸330至338），即具有免疫原性的RABV抗原。mAb-D1同时用于包被和检测疫苗批次中存在的糖蛋白三聚体。由于该表位的识别依赖于其构象特性，因此可能已变性（免疫原性较低）的糖蛋白无法被mAb-D1捕获和检测。待测疫苗在预先用mAb-D1致敏的酶标板中孵育。结合的三聚体RABV糖蛋白通过再次加入辣根过氧化物酶标记的mAb-D1进行识别，随后在底物和显色剂存在下显色。通过比较待测疫苗与参考疫苗的吸光度，可确定其免疫原性糖蛋白的含量。

引言

50 多年来，NIH 测试1 是用于在批次放行前评估狂犬病疫苗效力的金标准方法。该试验包括将待测疫苗通过腹腔免疫接种于若干组小鼠，14天后通过颅内（IC）途径以狂犬病病毒（RABV）挑战病毒标准株（CVS）进行攻击。疫苗效力根据颅内攻击后存活小鼠的比例进行评估。尽管世界卫生组织（WHO）2 欧洲药典3 仍需要通过NIH测试来评估疫苗效力，但该测试存在若干障碍：结果变异性较高4；在攻毒过程中使用具有感染性的狂犬病病毒（RABV），这需要熟练的技术操作和严格的生物安全措施；实验需使用大量动物，且攻毒的严重性引发严重的伦理关切5一种较温和的检测方法已被开发出来：在腹腔免疫接种两周后，不对小鼠进行颅内攻击，而是采血并利用体外中和试验检测其血清中是否存在特异性的狂犬病病毒中和抗体（VNAbs）。然而，该方法仍需牺牲大量实验小鼠，尽管其目前已用于兽用疫苗的检测。6,7 并已被考虑用于人类疫苗8.

目前，国际9和欧洲10的相关建议均鼓励生产商和国家控制实验室（官方药品控制实验室，OMCLs）实施实验动物测试的替代、减少和优化，即所谓的“3R”策略。欧洲指令2010/63/EU（自2013年1月1日起生效）涉及动物保护与福利，进一步加强了对狂犬病疫苗质量控制以及狂犬病研究相关疫苗生产商和实验室的约束11。因此，开发、验证和使用替代性的体外方法现已成为优先事项。这些方法不仅具有伦理上的合理性，还可降低批次检测成本，并将结果获取时间从数周缩短至数小时3。

在RABV颗粒表面，糖蛋白以三聚体形式存在12,13,14,15,16。在狂犬病疫苗中，这种天然的三聚体形式是诱导病毒中和抗体（VNAbs）的主要免疫原17，而单体、可溶性或变性的糖蛋白则免疫原性较弱18,19。因此，在疫苗生产过程中保持糖蛋白三聚体结构的完整性，是评估其最佳免疫原性潜力的良好指标。世界卫生组织技术报告系列2和欧洲药典3推荐了多种免疫化学方法用于定量狂犬病疫苗中的抗原含量，例如抗体结合试验20,21、单向放射免疫扩散（SRD）试验22以及ELISA试验23,24,25,26,27。这些方法被疫苗生产商用于监控疫苗生产的稳定性，也被官方药品检验实验室（OMCL）用于评估人用疫苗批次间配方的一致性28,尽管NIH效力试验仍被视为效力评价的参考方法。

然而，所有这些免疫化学方法并不等效。单向放射免疫扩散（SRD）试验需要进行预处理，这可能会改变膜锚定的三聚体结构，导致糖蛋白以可溶性或变性形式存在22,29。因此，SRD在区分免疫原性与非免疫原性糖蛋白方面效率较低，从而导致对疫苗批次免疫原性的评估不够准确。相比之下，酶联免疫吸附试验（ELISA）更为敏感22，能够保持糖蛋白的天然结构，更适合测定糖蛋白天然折叠三聚体的含量。ELISA可使用经硫酸铵纯化或浓缩的兔多克隆或鼠单克隆抗糖蛋白抗体。研究表明，NIH试验与通过ELISA测定的疫苗抗原含量之间具有良好的一致性，并得出结论：ELISA方法适用于体外 效力检测。这表明ELISA检测至少可作为NIH试验的补充，甚至可能取代NIH试验4,26,27,30,31,32,33。目前，欧洲药典已推荐使用经过验证的血清学或免疫化学检测方法作为NIH试验的替代方案3。完全避免在疫苗效力检测中使用动物已成为现实可行的目标。

以下所述方法基于一种间接ELISA夹心免疫捕获法，该方法使用一种小鼠单克隆抗体克隆（mAb-D1），可识别三聚体狂犬病病毒（RABV）糖蛋白的抗原位点III（氨基酸330至338）15,34。该方法最初由巴斯德研究所（Institut Pasteur）开发26,30，随后由法国药品和健康产品安全局（Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé，ANSM）实验室即法国国家控制实验室（OMCL）进行优化和验证4,33。mAb-D1既用于包被酶标板，也用于后续检测被捕获的抗原。该方法可实现对糖蛋白三聚体（即具有免疫原性的RABV抗原）的特异性定量。用于检测的mAb-D1以辣根过氧化物酶标记，在底物和显色剂存在下显色。通过比较待测疫苗与参考疫苗的吸光度，可确定其免疫原性糖蛋白含量。值得注意的是，类似类型的检测也可应用于识别RABV糖蛋白其他抗原位点的不同单克隆抗体35。此前已有大量文献详细描述了通过硫酸铵沉淀法获得、纯化或浓缩抗糖蛋白的兔多克隆IgG或小鼠单克隆免疫球蛋白的方法36，以及抗体与辣根过氧化物酶偶联的方法37。

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方案

1. 安全预防措施

注意：该方法适用于活体狂犬病病毒（RABV）和灭活疫苗。

  1. 遵循良好的实验室规范和安全操作程序。
  2. 穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括一次性实验服、手套、口罩、护目镜等。
  3. 当滴定活病毒时，应在II级生物安全柜中操作。
    1. 所有与样本接触过的材料（试剂、洗涤液等）均应视为具有传染性的物质。
    2. 将受污染的材料浸入含2.5%次氯酸钠的漂白剂溶液中30分钟，以进行去污处理。
  4. 根据良好实验室规范操作化学品。

2. 准备

  1. 尽可能使用分析纯试剂。
  2. 现配包被缓冲液/碳酸盐缓冲液、封闭缓冲液、稀释液和柠檬酸盐缓冲液（表1），经0.45或0.22 µm滤膜过滤后，于4 °C保存一天，使用前确保其分析纯度。
  3. 使用前30分钟将试剂平衡至室温（+18 °C至+25 °C），并轻轻混匀以确保均一。

3. 微孔板致敏

注意：使用经过优化、可高效结合免疫球蛋白的96孔吸附免疫测定板（例如，参见材料表）。

  1. 向每个孔中加入 200 µL 用碳酸盐缓冲液稀释的单克隆抗体（mAb-D1）。
    注意：经实验确定，最佳浓度约为 1 µg/mL，相当于纯化后的 mAb-D1 约 1/2000 的稀释度。每批 mAb-D1 的推荐浓度均已标明，必须定期使用阳性对照进行验证。
  2. 用粘性封板膜覆盖微孔板，并在 37 °C 湿润环境中孵育 3 小时。
  3. 小心抽吸，并将孔内液体转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
  4. 将微孔板倒置，室温下在吸水纸上干燥 5 分钟。

4. 微孔板钝化

  1. 向每个孔中加入 300 µL 封闭缓冲液。
  2. 用封板膜覆盖微孔板，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  3. 小心吸出孔内液体，并将内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的接收容器中。
  4. 将微孔板倒置，室温下置于吸水纸上干燥 1 分钟。
    注意：微孔板可立即使用，或密封后于 -20 °C 保存，最长可保存 3 个月，直至使用。

5. ELISA 检测

注意：建立参考疫苗的对照曲线时，无需执行步骤 5.3；而对被测疫苗进行滴定时，则必须完成所有步骤 5.1 至 5.6。

  1. 致敏微孔板的洗涤
    1. 向每个孔中加入 300 µL 洗涤缓冲液。
    2. 小心吸出孔内液体，并将内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
    3. 重复步骤 5.1.1 和 5.1.2 五次，以充分洗涤致敏板。
    4. 将微孔板倒置，室温下在吸水纸上干燥 1 分钟。
  2. 对照曲线用参考疫苗的稀释
    1. 用 1 mL 蒸馏水重悬参考疫苗（验证抗原批号 09），使其狂犬病毒糖蛋白浓度为 10 µg/mL。
    2. 用稀释液将重悬后的参考疫苗进行 10 倍稀释，得到 1 µg/mL 的狂犬病毒糖蛋白浓度。
    3. 按照 表 1 所示，用稀释液对该参考疫苗进行 6 次连续的 2 倍稀释。
    4. 在稀释液中每孔加入 200 µL，设两个复孔（孔 1H/2H），作为空白对照。
    5. 将每种参考疫苗稀释液每孔加入 200 µL，设两个复孔（孔 G1/G2 至 A1/A2）。
  3. 待测疫苗的稀释及其滴定
    1. 用稀释液对待测疫苗进行 10 倍稀释。
    2. 按照 表 2 所示，用稀释液对上述稀释液进行 7 次连续的 2 倍稀释。
    3. 将每种待测疫苗稀释液每孔加入 200 µL，设两个复孔（孔 H3/H4 至 A3/A4）。
  4. ELISA 板的孵育/洗涤
    1. 用粘性封板膜覆盖微孔板，于 37 °C 孵育 1 小时。
    2. 移除封板膜，小心吸出孔内液体，并将内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
    3. 向每个孔中加入 300 µL 洗涤缓冲液。
    4. 小心吸出孔内液体，并将内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
    5. 重复步骤 5.4.3 和 5.4.4 五次，以去除未结合的抗原，保留与包被抗体（mAb D1）结合的 G 蛋白三聚体。
    6. 将微孔板倒置，室温下在吸水纸上干燥 1 分钟。
  5. 辣根过氧化物酶标记的 mAb-D1 的结合
    1. 将推荐稀释度（1/2000）的辣根过氧化物酶标记 mAb-D1 稀释液每孔加入 200 µL（稀释液中浓度约为 1 µg/mL）。每批 mAb-D1 均有推荐浓度，需定期通过阳性对照验证。
    2. 用粘性封板膜覆盖微孔板，于 37 °C 孵育 1 小时。
    3. 移除封板膜，小心吸出孔内液体，并将内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
    4. 向每个孔中加入 300 µL 洗涤缓冲液。
    5. 小心吸出孔内液体，并将内容物转移至含有 2.5% 次氯酸钠溶液的容器中。
    6. 重复步骤 5.5.4 和 5.5.5 五次，以去除未结合的辣根过氧化物酶标记抗体（mAb D1）。
    7. 将微孔板倒置，室温下在吸水纸上干燥 1 分钟。
  6. 使用底物-显色剂进行显色
    1. 向每个孔中加入 200 µL 底物-显色剂溶液。
    2. 用封板膜密封微孔板，避光、室温孵育 30 分钟。出现黄色至橙色，其颜色强度与结合的辣根过氧化物酶标记抗体（mAb D1）量成正比。
    3. 每孔加入 50 µL 终止液以终止反应。
    4. 小心擦拭微孔板底部，将其放入分光光度计中，测定所有使用孔（阴性对照（空白）、参考疫苗和待测疫苗）在 492 nm 处的光密度（OD）。
    5. 以 .xls 或 .xlsx 文件格式收集 OD 数据用于分析。
  7. 绘制参考疫苗曲线：三聚体糖蛋白含量与光密度（492 nm）的关系
    1. 计算参考疫苗在不同稀释度下各复孔的 492 nm 处平均 OD 值（表 2 中的孔 G1/G2 至 A1/A2）。
    2. 从每个计算所得的平均 OD 值中减去空白孔（表 2 中的孔 H1/H2）的平均 OD 值。
    3. 以校正后的 OD 值为纵轴（线性刻度），对应的糖蛋白三聚体浓度（ng/mL）为横轴（对数刻度），绘制曲线。
    4. 连接各数据点绘制参考曲线（图 1）。

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结果

在以下示例中，使用参考疫苗批号09（由纯化的灭活狂犬病病毒颗粒组成，PV疫苗株）。该疫苗中糖蛋白三聚体（10 µg/mL）的含量是通过测定病毒总蛋白量（BCA法）并结合SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳评估糖蛋白所占比例后确定的。此外，也可使用经校准的参考疫苗，例如世界卫生组织第六代狂犬病疫苗国际标准品（WHO 6th International Standard，NIBSC编号：07/162）。

表3 显示了一次典型实验的OD值（492 nm）。利用这些值，通过以下方式绘制参考疫苗曲线：（1）以不同稀释度的参考疫苗的平均OD值（减去空白孔的平均OD值）作为纵坐标（线性刻度）；（2）以糖蛋白三聚体的浓度（ng/mL）作为横坐标（对数刻度）（图1）。

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讨论

单克隆抗体 mAb-D1 所识别的表位位于 RABV 糖蛋白的抗原位点 III，该位点不仅是诱导病毒中和抗体（VNAbs）的免疫优势区域，还参与神经毒力、致病性40,41以及受体识别42。在糖蛋白上还存在另一个重要的抗原位点，即抗原位点 II43，已从中分离出多种单克隆抗体，例如 mAb-WI-111235。这些抗体也可用于类似类型的实验。

ELISA体外方法的一个局限性在于，所使用的单克隆抗体识别的表位必须在待测狂犬病病毒株中保持保守。迄今为止，用于人用狂犬病疫苗的所有经典毒株均可被mAb-D1识别。然而，动物疫苗中使用的狂犬病病毒株具有更高的多样性，未来可能构成问题。不过，如前所述，可通过使用识别RABV糖蛋白不同抗原位点的其他单克隆抗体作为包被和检测抗体，应用相同的检测方法，从而克服这一问题

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Sylvie Morgeaux 博士和 Jean-Michel Chapsal 博士在建立疫苗批次 ELISA 检测方法以及组织国际研讨会和协作研究中所作出的重要贡献。感谢 Sabrina Kali 对稿件的审阅。Pierre Perrin 博士负责单克隆抗体 mAb-D1 的分离与表征。本工作主要由巴斯德研究所提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
II 级生物安全柜ThermoFisher Scientific10445753若对活病毒进行滴定
透明平底免疫非无菌96孔板，400 µL，MAXISORPThermoFisher Scientific439454有利于与负载的抗体结合
Equip Labo 聚丙烯实验室通风橱ThermoFisher Scientific12576606用于硫酸的配制
免疫学强结合板
MAXISORP 平底吸附
96孔板		Dutscher55303有利于与负载的抗体结合
微孔板封板膜（100片）ThermoFisher Scientific15036
微量滴定板  单模式读板机 SunriseTECAN
微孔板振荡孵育器Dutscher441504
酶标洗板机 WellwashThermoFisher Scientific5165000
多通道移液器（30-300 µL）12通道ThermoFisher Scientific4661180N
单通道移液器（试剂盒 2：Finnpipettes F2 0.2-2） μ2-20 微升 μL，20-200 μL && 100-1000 μL)ThermoFisher Scientific4700880

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