En semi-kvantitativ stof affinitet lydhør Target stabilitet (dart) assay til at studere Rapamycin/mTOR interaktion
Summary
I denne undersøgelse forbedrede vi dataanalyse mulighederne i dart eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten og anslå affiniteten af protein-ligand-interaktioner. Samspillet kan afbildes i to kurver: en proteolytisk kurve og en dosis afhængigheds kurve. Vi har brugt mTOR-Rapamycin interaktion som et eksemplarisk tilfælde.
Abstract
Drug affinitet lydhør Target stabilitet (dart) er en robust metode til påvisning af nye små molekyle protein mål. Det kan bruges til at verificere kendte små molekyle-protein interaktioner og til at finde potentielle protein mål for naturlige produkter. Sammenlignet med andre metoder bruger dart indfødte, umodificerede, små molekyler og er enkel og nem at betjene. I denne undersøgelse forbedrede vi yderligere dataanalyse mulighederne i dart eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten og vurdere affiniteten af protein-ligand-interaktioner. Proteinet-ligand-interaktioner kan afbildes i to kurver: en proteolytisk kurve og en dosis afhængigheds kurve. Vi har brugt mTOR-Rapamycin interaktion som en eksemplarisk sag for etablering af vores protokol. Fra den proteolytiske kurve så vi, at proteolysen af mTOR ved pronasen blev hæmmet af tilstedeværelsen af Rapamycin. Dosis-afhængigheds kurven gjorde det muligt for os at estimere den bindende affinitet af Rapamycin og mTOR. Denne metode er sandsynligvis en kraftfuld og enkel metode til præcist at identificere nye målproteiner og til optimering af Drug Target engagement.
Introduction
Identifikation af små molekyle målproteiner er afgørende for den mekanistiske forståelse og udvikling af potentielle terapeutiske stoffer1,2,3. Affinitets kromatografi, som en klassisk metode til at identificere målproteiner af små molekyler, har givet gode resultater4,5. Men denne metode har begrænsninger, i at kemisk modifikation af små molekyler ofte resulterer i reduceret eller ændret bindende specificitet eller affinitet. For at overvinde disse begrænsninger, er flere nye strategier for nylig blevet udviklet og anvendt til at identificere de små molekyle mål uden kemisk modifikation af de små molekyler. Disse direkte metoder til identifikation af etiket frie små molekyler omfatter Drug affinitet lydhør Target stabilitet (dart)6, stabilitet af proteiner fra oxidations hastigheder (sprox)7, cellulære termisk Shift assay (cetsa)8 ,9og termisk proteom profilering (TPP)10. Disse metoder er meget fordelagtige, fordi de bruger naturlige, umodificerede små molekyler og kun stole på direkte bindende interaktioner for at finde Target proteiner11.
Blandt disse nye metoder, dart er en forholdsvis enkel metode, der nemt kan vedtages af de fleste Labs12,13. DART afhænger af konceptet om, at ligand-bundne proteiner udviser modificeret modtagelighed for Enzymatisk nedbrydning i forhold til ubundne proteiner. Det nye målprotein kan påvises ved undersøgelse af det ændrede bånd i SDS-PAGE gel gennem væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS/MS). Denne tilgang er blevet gennemført med succes for at identificere tidligere ukendte mål for naturlige produkter og narkotika14,15,16,17,18, 19. det er også kraftfuld som et middel til at screene eller validere binding af forbindelser til et bestemt protein20,21. I denne undersøgelse præsenterer vi en forbedring af eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten med små molekyler og identificere protein-ligand bindende tilhørsforhold. Vi bruger mTOR-Rapamycin interaktion som et eksempel for at demonstrere vores tilgang.
Protocol
Representative Results
Discussion
DART giver mulighed for identifikation af små molekyle mål ved at udnytte den beskyttende effekt af proteinbinding mod nedbrydning. DART kræver ingen kemisk modifikation eller immobilisering af det lille molekyle26. Dette gør det muligt at bruge små molekyler til at bestemme deres direkte bindende protein mål. Standard vurderingskriterier for den klassiske dart metode omfatter gel farvning, massespektrometri og Western blotting12,13….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH Research Grants R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 og et FORSVARS forskningsstipendium W81XWH-16-1-0482.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
