Robust ligatur-indusert modell av murine periodontitt for evalueringen av muntlig nøytrofile

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll for å etablere en ligatur-indusert modell av murine periodontitt involverer flere maksillære jeksler, noe som resulterer i større områder av den involverte gingival vev og bein for senere analyse samt redusert dyre bruk. En teknikk for å vurdere muntlig nøytrofile på en måte analoge til menneskelige er også beskrevet.

Abstract

De viktigste fordelene ved å studere patofysiologi av periodontal sykdom utnytte murine modeller er de reduserte kostnadene for dyr, rekke genmodifiserte stammer, det store antall analyser som kan utføres på høstet myke og harde vev. Men mange av disse systemene er gjenstand for prosessuelle kritikk. Som et alternativ, ligatur-indusert modell av periodontal sykdom, drevet av den lokaliserte utvikling og oppbevaring av en dysbiotic oral mikrobiomet, kan benyttes, som er raskt indusert og relativt pålitelig. Dessverre er variantene av ligatur-indusert murine periodontitt protokoll isolert til fokal områder av periodontium og utsatt for prematur avulsion av den installerte ligatur. Dette minimerer mengden av vev tilgjengelig for senere analyser og øker antall dyr som kreves for studier. Denne protokollen beskriver presise manipulasjoner som kreves for å plassere utvidet molar ligaturer med forbedret oppbevaring og bruk av en roman skylle teknikk for å gjenopprette muntlige nøytrofile i mus med en alternativ tilnærming som begrenser de nevnte tekniske utfordringer.

Introduction

Periodontal sykdom (PD) er en osteolytiske tilstand forbundet med betydelig vert sykelighet og økonomisk byrde, som er manifestert ved gingival betennelser og tap av både bløtvev vedlegg og fluorose støtte for de berørte tennene^1,2,3,4. Denne prosessen styres av interaksjoner mellom det muntlige bakterieflora og medfødte immunsystemet til verten. Det er også forbundet med forverring av andre systemiske inflammatoriske sykdommer, inkludert diabetes, hjerte-og karsykdommer, og kreft^5,6,7,8. Historisk var det hypotetisk gjennomsnitt at PD-patogenesen er avhengig av store mengder spesifikke bakterier som Porphyromonas gingivalis⁹. Men, tyder nyere bevis på at den mikrobielle komponenten av PD er formidlet av Dental biofilm. Den biofilm er en organisert, komplekst fellesskap av mange mikroorganismer som kan eksistere i sunne symbiotisk og destruktive dysbiotic stater^10,11. Den muntlige biofilm normalt gir motstand til verten ved å hindre etablering av fokus på patogene bakterier og fremmer ideell gingival vev struktur og funksjon gjennom regulering av verten immunrespons^12,13. Forstyrrelser av equilibrious forholdet mellom Commensal organismer i munnhulen og verts immunforsvaret kan føre til endringer i vev homeostase, noe som resulterer i dysbacteriosis og utvikling av Hallmark klinisk og radiografisk opptredener av PD^{5,10,12,13,14}.

Interessant, etablering av en muntlig dysbacteriosis, mens nødvendig for initiering av PD, er ikke tilstrekkelig til å drive PD i alle individer, eluding mot evnen til verten immunforsvaret til å undergrave overgangen av bakterieflora mellom symbiotisk og dysbiotic stater¹⁵. Dette plasserer en bestemt søkelys på midlene der PD påvirker en av de ledende karakterene i det medfødte immunsystemet, nemlig polymorfonukleære granulocytt (PMN), eller nøytrofile, fra lokale og systemiske perspektiver^16,17.

Hos mennesker, PMN er rekruttert fra sirkulasjonen med en hastighet på ~ 2 x 10⁶ celler/h i sunne periodontal bindevev, hvor de er de predominating leukocytter befolkning. Her er de senere utvist fra gingival sulcus inn i munnhulen som en del av gingival crevicular væsken. I nærvær av PD, neutrophilia manifesterer innenfor sirkulasjon og munnhulen, hvor disse Effektor celler besitter en hyperinflammatory fenotype som fører til de nevnte ødeleggelsen av periodontium^{17,18,19,20,21,22}. Derfor er forståelsen av rollen til PMN i PD og andre systemiske inflammatoriske tilstander av største betydning.

Selv om det er allment akseptert at kroniske sykdommer er gjensidig knyttet til PD, de underliggende mekanismene har ennå ikke belyst, bidra til vanskeligheter i forvaltningen av disse sykelig og potensielt fatale systemiske forhold. Mangfoldig eksperimentelle dyr modeller, hver med enestående fordeler og ulempen, ha blitt anvende å studere patofysiologi av PD^23,24. Fokuserer spesielt på murine modeller, er det en rekke protokoller der studiet av PD er tilrettelagt; men de har flere tekniske og fysiologiske svakheter^{25,26,27,28,29,30,31}.

For det første, det muntlig gavage musen modell behøver tallrik muntlig vaksiner av Human periodontal patogener å utvikle gingival betennelse og Ben forlis. I tillegg er det vanligvis innledes med en periode med antibiotika behandling for å undergrave den murine Commensal oral flora²⁵. Denne modellen krever ofte spesialisert trening for å trygt utføre muntlige gavage, bruker bare en liten brøkdel av periodontal patogener fra de mer komplekse menneskelige muntlige mikrobiomet, og krever flere måneder å etablere alveolære bein tap.

I kontrast, kjemisk indusert murine modeller benytte muntlig levering av trinitrobenzene sulfonsyrer syre (TNBS) eller dextran sulfat natrium (DSS), agenter som vanligvis brukes i å etablere murine modeller av kolitt over en periode på flere måneder for å indusere periodontal bein tap²⁶. Intraorale og extraoral abscess-baserte modeller er tilgjengelig, som involverer murine fortenner og vev av antecubital samt calvarium, henholdsvis. I den tidligere abscess modellen, flere injeksjoner av bakterier administreres, skape flere gingival abscesser og en mangel av alveolære bein tap, begrense deres bruk i studiet av PD. Sistnevnte abscess modeller er betydelig mer tilbøyelige til å studere bakteriell virulens, betennelser, og bein resorpsjon på steder utenfor munnhulen, som eliminerer evaluering av periodontium og muntlig mikrobiomet^{27,28,29,30,31}.

Ved hjelp av ligatur-indusert modell av periodontitt, en flettet silke Sutur har ofte blitt installert circumferentially rundt andre molar. Som et alternativ, kan en enkelt lineær segment av Sutur materiale settes inn mellom første og andre jeksler^32,33. Målet med ligatur plassering er å lette bakteriell akkumulering og generere dysbiosis innenfor gingival sulci, noe som resulterer i periodontal vev betennelser og ødeleggelse av vev komponere periodontium. Mest spesielt er denne modellen i stand til å produsere betydelig mer alveolære bein tap i forhold til de mer brukte muntlige gavage modell³⁴. Videre kompliserer bruken av oral gavage modellen er den naturlige motstanden av flere stammer av mus (dvs. C57BL/6) til å utvikle alveolære bein tap. Denne er likeledes problematisk, idet denne belastning er de fleste hyppig anvendt inne murine-basert dyr forskning³⁵.

Eksisterende prosedyrer beskrevet av Marchesan et al. og Abe og Hajishengallis ble utviklet for å forenkle den tekniske handlingen å plassere ligatur^33,36. Dessverre krever den tidligere protokollen spesialisert 3D-trykt utstyr og har potensial for prematur ligatur tap, og dermed øke dyr bruk og kostnadene forbundet med ekstra tid brukt i operasjonsstuen. Videre genererer begge protokollene bare små områder av de syke periodontium som er tilgjengelige for en studie.

Fordelene som ligger med denne teknikken er jordet i samtidige studier av oral dysbiosis og immunologi som regulerer periodontium, utnyttelse av rimelige dyr med ulike genetiske bakgrunner, og enkle boliger og husdyrhold praksis. Som sådan bør mål være å maksimere volumer av syke vev og, i forsøk på å praktisere prinsippene for reduksjon i animalsk forskning, redusere animalsk forbruk til et nivå så lavt som mulig. Dette krever at alle dyr er i stand til å bli inkludert i eksperimentelle analyser³⁷. Imidlertid bør det bemerkes at uansett hvilken dyremodell av periodontal sykdom er utnyttet, er det ingen enkelt modell som omfatter hvert element av menneskelig PD patofysiologi.

Denne nye protokollen sysselsetter plasseringen av en ligatur rundt flere maksillære molar tenner ved hjelp av instrumentering og materialer som finnes i de fleste laboratorier. Den innrømmer en nok beløpet av tid å lett og trygt installere en ligatur det er usannsynlig å avulse for tidlig. Til slutt, som PMN koordinere ødeleggelsen av periodontium i PD, en ny metodikk for å gjenopprette muntlige nøytrofile på en måte som tilsvarer mennesker er også presentert.

Protocol

Alle murine studier overholdt de relevante etiske forskriftene og ble godkjent av University of Toronto Animal Care Committee og forskningsetikk styret (protokoll 20011930). 1. ligatur installasjon Merk: Dette er en ikke-steril kirurgisk prosedyre som kan utføres i et standard operasjonsteater. Bruk av bakteriefrie dyr (dekkes ikke her) mandater håndtering i et biosafety kabinett, bruk av sterile instrumenter, og inoculation av munnhulen med periodontal patogener å…

Representative Results

Representative Flow flowcytometri data fra Oral skylling prøver av en naiv (Figur 3a) og betent (Figur 3B) murine munnhulen sekundært til ligatur-indusert periodontitt er gitt. Gjenoppretting av PMN fra en installert ligatur er også demonstrert (Figur 3C). Flow flowcytometer kanal spenninger ble kalibrert manuelt, og kompensasjon ble utført med single-beiset kompensasjon perler….

Discussion

Den mest kritiske element knyttet til bruk av murine ligatur-indusert modell av periodontitt er sentrert rundt oppbevaring av ligatur til tidspunktet for offer eller tilsiktet fjerning. Den installerte biofilm-retentive-ligatur er i stand til å indusere et betydelig tap på alveolære Ben høyde på så lite som 6 dager, plateauing mellom 11 – 16 dagers perioden³⁹. Beslutningen om å ofre dyr før maksimal periode med bein tap, gjengi dette en mye kortere modell av ligatur-indusert periodontitt…

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL